広視野の共焦点レーザー顕微鏡システムにより、マクロからミクロまでを捉えた骨格筋線維形成メカニズム

2022年4月

骨格筋の形成は、間葉系幹細胞におけるマスター転写因子(Pax7、MyoD、Myogenin)の発現による筋芽細胞への分化に始まる。その後、MyomakerやMyomixer等の分子が筋芽細胞を融合（多核化）させ、骨格筋線維へと成熟化させる。骨格筋線維の形成にあたり、単核の筋芽細胞はアクチン、チューブリン等からなる細胞骨格を再編成し、縦に伸びた形態を示す。この時、縦長の細胞は高密度になると隣同士の細胞が向きを揃え、局所的な秩序相を形成する。この細胞集団を巨視的に見ると特徴的な渦状パターンを示し、その後の骨格筋線維に引き継がれる。一方、細胞集団がうまく向きを揃えられていない箇所は、秩序相に対してトポロジカル欠陥と呼ばれ、単核の丸い細胞の集積が観察される。このような筋芽細胞集団の渦状パターン形成は、その後の多核化と骨格筋線維への成熟化に重要である可能性がある。
北海道大学 大学院医学研究院 生化学分野 分子生物学教室の麓佳月氏、及川司講師らは、筋芽細胞集団が渦状パターンを形成するための必要条件となる分子機構の解明を目指し、転写因子や膜融合分子、細胞骨格分子等の微視的分子動態が、いかにして細胞集団、あるいは組織レベルの巨視的表現系に結びつくかという問いに答えるべく挑んでいる。
本アプリケーションノートでは、共焦点レーザー顕微鏡システムが捉えた、細胞内の関連分子の挙動および細胞集団の巨視的パターンについて紹介する。

共焦点と薄片作製技術が明らかにした、琥珀に閉じ込められた化石ゴキブリの生態

2022年2月

昆虫の感覚器官は、外界の情報を探知する極めて重要な役割を担っている。これらは小さいサイズや少ない神経細胞数により強い制約を受けている一方で、脊椎動物にも劣らない非常に優れた情報処理能力を有しており、全動物種の70%を占める昆虫の大繁栄を支えてきた核心的要因のひとつと考えられている。そのため、昆虫を対象とした進化古生物学的研究において、感覚器官を調査することは重要である。
北海道大学大学院理学院の谷口諒氏、伊庭靖弘准教授、同大学電子科学研究所の西野浩史助教、同大学総合博物館の山本周平博士、福岡大学理学部地球圏科学科の渡邉英博助教は、ゴキブリの仲間であるHuablattula huiのオスの琥珀化石において、琥珀基質をギリギリまで除去しつつ且つ感覚器官が埋没した状態のプレパラートを作製した。これを共焦点レーザー顕微鏡システムで撮影することにより、微小な感覚器官の解析が、化石昆虫の詳細な生活様式の復元に極めて有効であることを示した。本アプリケーションノートでは、その研究成果における共焦点レーザー顕微鏡システムの寄与について紹介する。

Organ-on-a-chipを用いた、CAR-T細胞動態の共焦点イメージング

2022年2月

CAR-T(Chimeric Antigen receptor T)細胞療法による免疫効果の評価は、主に動物実験モデルにより行われているが、コストや時間がかかる事が課題である。本アプリケーションノートでは、 AIM Biotech社製の3D細胞培養チップを用いてシンプルな3D免疫細胞傷害性アッセイモデルを構築し、in vitroイメージングによりT細胞の免疫効果を測定した例を紹介する。3Dアッセイモデルは、がん微小環境の条件やT細胞の調製などin vitroでのさまざまな条件検討を容易にし、目的に応じて多様にカスタマイズできることが特徴である。このアッセイにより、in vitroにおける細胞のより時空間的な動態（spatiotemporal dynamics）を再現し、2Dモデルよりも生理学的な条件（physiological condition）で、免疫細胞を介した殺傷性の観察と計測を行うことが可能である。

Segment.aiを使用した、ウサギ骨小腔の形態の自動抽出

2021年12月

硬い骨の中では、骨細胞どうしが神経細胞ネットワークのように細胞間ネットワークを構成している。北海道大学大学院歯学研究院薬理学教室の飯村忠浩先生、佐藤孝紀先生らは、このネットワーク構造を可視化して計測し、その機能的意義を研究されている。しかし、骨細胞は骨細胞突起（細胞体から出る無数の細胞突起）と連続した構造を持つため、従来の蛍光二値化法では、個々の細胞形態の抽出が困難であった。本アプリケーションノートは、顕微鏡AIモジュールNIS.aiの機能の一つである「Segment.ai」を利用することにより、骨小腔のセグメンテーションを自動化し、簡便に数を計測した例を紹介する。

血管新生の3Dモデルを用いた血管形成誘導の経時的イメージング解析

2021年12月

がん、動脈硬化、慢性炎症、虚血などのさまざまな疾患や病態の開始および進行には、血管の恒常性維持機能の低下が関与することが知られている。このような背景から、血管新生などによる新規血管構造の形成あるいは微小血管の損傷に関する詳細なメカニズムを把握する事は非常に重要である。本アプリケーションノートでは、Mimetas社の3D組織培養プラットフォームOrganoPlate®を利用した3D血管新生構造（in vitro灌流血管新生モデル）を共焦点レーザー顕微鏡システムAX/AX Rを用いて詳細に観察、解析した例を紹介する。

微分干渉および共焦点による、イネいもち病菌感染関連形態形成イメージング

2021年12月

いもち病はイネの最も深刻な病害である。子嚢菌門の一種であるイネいもち病菌（Magnaporthe oryzae）はイネいもち病を引き起こす半活物寄生性病原体として知られており、いもち病菌がイネの葉、茎、穂に感染すると米の収量の大幅な低下を引き起こす。この病害に対する新たな防除法の確立や耐性のあるイネ品種の開発を目指すためには、いもち病菌とイネの間の遺伝子間およびタンパク質間相互作用の詳細を明らかにすることが重要である。本アプリケーションノートでは、東京農業大学 の齋藤宏昌先生らによって報告された、植物ー病原菌相互作用中の差次的遺伝子発現評価手法を用いた新規病原性遺伝子の同定に関する論文における、CFI アポクロマート Lambda S 40XC WI対物レンズを用いた微分干渉と共焦点によるイメージングの活用事例について紹介する。

Denoise.aiを使用した、レゾナントスキャナーによる高速高解像度3Dイメージング

2021年11月

レゾナントスキャナーは高い時間分解能での共焦点イメージングが可能なため、生細胞イメージングに適しているが、解像度の点においてはガルバノスキャナーのほうが優れている。しかし、共焦点レーザー顕微鏡システムAX Rのレゾナントスキャナーは、２Kのピクセル解像度を実現しているため、高解像度な画像を高速で取得できる。さらに、画像統合ソフトウェアNIS-Elementsの顕微鏡用AIモジュールDenoise.aiを使用することにより、レゾナントスキャンの際に発生するショットノイズの除去が可能である。露光時間を短縮し光退色を低減できるため、固定標本の画像取得にも有効である。本アプリケーションノートでは、Denoise.aiを使用することにより、レゾナントスキャナーを使用して高精細画像を高速で取得した例を紹介する。

レゾナントスキャナーを使用した、 マウス神経筋接合部の高精細イメージング

2021年11月

レゾナントスキャナーは、ガルバノスキャナーよりも高い時間分解能での共焦点イメージングが可能なため、多く のケースにおいて高速の生命現象の取得に使用される。それに対して、新世代共焦点レーザー顕微鏡システム AX Rのレゾナントスキャナーは、最大2Kまでの取得にも対応できるため、高速イメージングから高精細イメージ ングまでの幅広い目的で使用可能になった。本アプリケーションノートでは、レゾナントスキャナーを用いて、 マウスの神経筋接合部の構造を高精細3次元イメージングで観察した例を紹介する。

マウス皮質興奮性ニューロンの3D高解像度共焦点イメージングにより、動態、制御、機能の異なる多様な樹状突起棘を解明

2021年11月

本アプリケーションノートでは、ニューロンを強力な蛍光で標識し、Nikonレーザースキャニング共焦点イメージングのパラメーターを最適化し、取得画像に対してNIS-Elementsソフトウェアにより反復3Dデコンボリューションを行った（Zaccard、et al., 2021）。この手法により、シナプス前およびシナプス後マーカーと関連付けて個々の棘突起を可視化し追跡することが可能になり、動態、長さ、寿命、制御、機能などの異なるさまざまな棘突起のサブタイプが明らかとなった（Zaccard et al., 2020）。

細胞の動きや状態変化を広視野で効率的に共焦点イメージング

2021年11月

大阪大学大学院医学系研究科の石井優教授（免疫細胞生物学）らの研究グループは、顕微鏡イメージングの手法を用いて細胞を動的に可視化することで、生体内で腫瘍細胞がどのように動いているのかを研究しています。本アプリケーションノートでは、ニコンの共焦点レーザー顕微鏡システムAXRを使用し、本顕微鏡の特徴である広視野を活かして、腫瘍細胞の動きや状態変化の様子を的確に捉えた画像取得の例を紹介します。

高速な動きを鮮明に捉えるマウス臓器のin vivo共焦点イメージング

2021年11月

大阪大学大学院医学系研究科の石井優教授免疫細胞生物学らの研究グループは、顕微鏡イメージングの手法を用いて細胞を動的に可視化することで、生体内で免疫細胞がどのように動いているのかを研究しています。本アプリケーションノートでは、ニコンの共焦点レーザー顕微鏡システム
AX R を使用し、本顕微鏡の特徴の一つである高速レゾナントスキャンを活かして、臓器の血流内を流れる細胞の素早い動きをin vivoの状態で捉えた画像取得の例を紹介します。

レゾナントスキャナーを用いた超短時間レーザー励起によるライブイメージング

2021年8月

エンテロイドは、Paneth細胞が担う自然免疫応答である抗菌ペプチドαディフェンシン分泌をはじめとする、腸上皮機能を研究するための優れたツールである。しかし、エンテロイドは温度や湿度などの環境だけでなく、レーザー走査型顕微鏡による光照射に対しても非常に敏感であるため、実験においては慎重に扱う必要がある。本アプリケーションノートでは、蛍光色素の光退色のみならず、Paneth細胞における顆粒分泌に着目した腸上皮細胞機能への光毒性の影響を評価することで、レゾナントスキャナーによる超短時間レーザー光照射の利点について紹介する。

生きた骨組織内の骨芽細胞と破骨細胞の相互作用を可視化する技術を開発

2021年8月

大阪大学大学院医学系研究科の石井優教授（免疫細胞生物学）らの研究グループは、組織深部の観察が可能な多光子共焦点レーザー顕微鏡システムA1R MP+を使用して、生きたままの骨の内部を観察し、新しい骨を造る“骨芽細胞”と古い骨を溶かす“破骨細胞”を同時に可視化する技術を開発した。本アプリケーションノートでは、生体骨組織内において、骨芽細胞と破骨細胞が直接接触しコミュニケーションをとる瞬間を捉えることに世界で初めて成功した例を紹介する。

破骨細胞のポドソームの広視野・高解像共焦点イメージング　～マクロとミクロの両立～

2021年7月

北海道大学大学院 歯学研究院 薬理学教室の飯村忠浩先生と李智媛先生らは、骨格系の発生・発達・恒常性維持・老化・薬理学の観点から、ライフスパンでの骨・関節の研究をされている。破骨細胞の骨との接着面には、「アクチンリング」と呼ばれる環状構造があり、その構成要素である「ポドソーム」の微細構造を観察するためには、これまで電子顕微鏡の分解能が必要であった。本アプリケーションノートでは、新世代共焦点レーザー顕微鏡システムAXを使った破骨細胞のマクロ観察と、ポドソームのミクロ観察およびその定量解析の例を紹介する。

深部まで明るく鮮明に構造をとらえる ～対物レンズの選び方～

2021年6月

屈折率のミスマッチに起因する「球面収差」は、画像の解像度や輝度の低下の原因となり、イメージングにおける課題の一つである。本アプリケーションノートでは、小腸上皮細胞三次元培養系であるエンテロイド(Enteroid)の三次元イメージングを例に、「球面収差」の影響を明示し、適切な浸液と対物レンズの選び方について紹介する。

腸管オルガノイドの３次元イメージング

2021年6月

共焦点イメージングにおいて、標本深部まで高解像度で観察するためには、対物レンズの選択が非常に重要である。本アプリケーションノートでは、国立研究開発法人国立成育医療研究センター 研究所再生医療センター 生殖医療研究部の阿久津英憲先生と川崎友之先生にご協力いただき、２種類の異なる対物レンズを用いて小腸オルガノイドの３次元イメージングを行い、画質の違いを比較した例を紹介する。

Organ-on-a-Chipを使用し、 in vitro でヒト組織の生理学的複雑さを把握

2021年4月

3D細胞培養により、 ２D細胞培養よりも生体内により近い環境を作り出し、in vitro で細胞の生理学的組成や空間配置を再現することが可能である。本アプリケーションノートでは、ニコンの共焦点レーザー顕微鏡システムA1R HD25を使用して、 3D組織培養プラットフォームであるOrganoPlate®（製造元：MIMETAS）によりモデルの開発を行った例を紹介する。

高速ポイントスキャン共焦点顕微鏡を利用した、オンチップ生体培養の定量三次元解析

2021年1月

Organs-on-chips（臓器チップ）は、標準的な二次元組織培養システムよりも、生体組織の三次元構造および機能の複雑さを忠実に再現できます。しかし、この高度な細胞培養プラットフォームの画像取得をベースとするアプリケーションにおいては、技術的な課題があります。本アプリケーションノートでは、ニコンのA1R HD25ポイントスキャン共焦点顕微鏡およびCFI S Plan Fluor LWD 20XC対物レンズ、NIS-Elementsソフトウェアを使用して、Emulate社のOrgan-Chipプラットフォーム上で生細胞を高速かつ深部まで定量的にイメージングした例を紹介します。

小腸上皮細胞三次元培養系を用いた、パネト細胞による自然免疫応答のライブイメージング

2021年1月

小腸上皮細胞であるパネト細胞（Paneth cell）は、自然免疫のエフェクターである抗菌ペプチドαディフェンシン（α-defensin）を豊富に含む顆粒を、コリン作動性刺激や細菌刺激などに応答して分泌することで、病原体を排除し、常在菌とは共生して腸内細菌叢を制御している。本研究では、小腸上皮細胞三次元培養系であるエンテロイド（enteroid）を用いて、パネト細胞の顆粒分泌応答をex vivo ではじめて可視化・定量化し、αディフェンシン分泌メカニズムを明らかにした。

超解像顕微鏡と共焦点顕微鏡を用いた、ミクログリアと神経細胞体の接合部の可視化

2020年7月

ミクログリアは脳の主要な免疫細胞であり、脳の恒常性や神経疾患に関与しています。しかし、ミクログリアと神経細胞間の伝達に関する根本的なメカニズムは未解明のままです。本アプリケーションノートでは、共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡を用いて、神経細胞とミクログリアの結合部位の構造をナノスケールで明らかにした例を紹介しています。

画像統合ソフトウェアNIS-ElementsのDenoise.ai機能：ディープラーニングを応用して共焦点画像からノイズを除去

2020年1月

共焦点画像では、サンプルから連続的に放出される光子を慎重にデジタルサンプリングする過程において、必然的にノイズが発生します。ノイズが画質（S/N比）に及ぼす影響は、蛍光シグナルが減少するのに伴い、平方根関数に従って増加します。学習済みニューラルネットワークを使用することで、AIを応用して共焦点画像からショットノイズ成分の除去が可能です。これにより、画質を向上させ、シグナルの弱い画像でも高速取得を実現します。画像統合ソフトウェアNIS-ElementsのDenoise.ai機能は、学習済みニューラルネットワークを搭載し、ライブ画像や取得済み画像に対してノイズ除去の処理が行えます。

A1R HD25: 定評のある高速レゾナントスキャンの最新技術が開く、新たなライブセルイメージングのアプローチ。

2019年2月

生きている生物の動態を記録するには高速の画像取得速度が必要です。 たとえばモデル生物全体などの大型の標本には、それに加えて大きな視野も必要です。 ニコン共焦点顕微鏡システムA1R HD25は、さらに進化したニコンのHD高速レゾナントスキャナーと、かつてない25㎜という広視野を同時に実現しました。 このシステムの性能は、ゼブラフィッシュの胚への適用で評価されています。

共焦点顕微鏡の視野を拡大し、現象を忠実に画像取得

2018年11月

これまで共焦点顕微鏡の視野数（FOV）は、搭載される顕微鏡の視野数によって制限されてきました。しかし、ニコンの倒立顕微鏡Ti2の登場により、世界で初めて25㎜の視野数が実現し、その優位点を生かしてニコンは、世界最大の視野数を持つ共焦点顕微鏡A1 HD25を開発しました。

日常の実験に役立つ、この技術の効果についてご紹介します。

共焦点観察と比較した構造化照明顕微鏡法（SIM）

2018年9月

これまでの構造化照明顕微鏡（SIM）は、光の散乱や光学収差に起因する励起レーザーの縞パターンの劣化という課題により、固定組織の神経細胞における樹状突起スパインの観察にはあまり用いられていませんでした。