アプリケーションノート

運動神経オルガノイドの長期間高解像度タイムラプスイメージング

mCherryを発現するヒトiPS細胞から分化した運動神経細胞を三次元組織化し、細い通路を持つマイクロデバイス内に入れた。なお、96ウェルガラスボトムプレートの各ウェルに収まるサイズのマイクロチップを作製して使用した。

インキュベーター内で培養しながら、プレートを共焦点システムを搭載した倒立顕微鏡のステージに一定間隔で自動的に搬送し、電動ステージを用いて多数のウェル内の神経組織を自動的にタイリング撮影した（2時間ごとに連続9日間）。

結果

ヒトiPS細胞から得られた運動神経細胞の軸索の伸長と自己組織化には１週間以上を要する。しかし、インキュベーターと共焦点顕微鏡を連結した自動培養顕微鏡イメージングシステム BioPipeline LIVEを用いることにより、その全過程を切れ目なく観察することができた（図2、3）。タイムラプスイメージングを高解像度で長期間にわたって行うことにより、無数の軸索同士が複雑な相互作用を経て最終的に束状に自己組織化する過程が明らかになった（図2、3） 。

まとめ

インキュベーターと共焦点顕微鏡を連結した自動培養顕微鏡イメージングシステム BioPipeline LIVEは、長期間タイムラプスイメージングと高解像度イメージングの両方を可能にする。

今回の観察により、細胞体付近では、放射状に伸びる軸索と円弧状に集まる軸索が絡まり合いながら、最終的には全ての軸索が通路方向に伸びることが明らかになった（図３b） 。また、現象の生理学的意義とその機構については今後詳細な検討が必要ではあるが、通路内で軸索束が形成する際に、軸索上の輝度の高い点が細胞体側に引き寄せられながら集まる過程を見出すことができた（図３a） 。

厚みのある三次元組織において、細かな軸索を観察するためには広いエリアを高解像度かつZ方向にも観察する必要があるが、BioPipelineLIVEに装着した共焦点顕微鏡でタイリング撮影＋Zスタック撮影を簡単に行える。何枚もの96ウェルプレートを自動で解析できるため、スクリーニングへの応用も期待できる。

謝辞

本アプリケーションノートの作成にあたり、画像のご提供ならびに研究内容のご教示を賜りました東京大学 生産技術研究所 の池内与志穂先生とドゥンキー智也氏に深謝致します。