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光学顕微鏡の解像度は数百年もの間、光の回折による制限を受け、約200 nmがXY解像度のおおよその限界と考えられてきました。これは、単一細胞や細胞レベル以下の構造を観察するには十分であるかもしれませんが、オルガネラ以下のサイズの微細構造や、ナノオーダーの生体一分子を観察するには十分であるとは言えません。
近年になり、この回折による限界を超えるためのさまざまな技術を活用した、「超解像」光学イメージング技術が数多く開発されています。超解像イメージングの重要性は2014年のノーベル化学賞においても認められ、軸索の周期的な足場構造など、すでにさまざまな発見に対して貢献しています。
アクチンを蛍光標識した神経細胞培養の3D-STORM画像。(Z位置を色で表示)
撮影ご協力:Dr. Christophe Leterrier, CR1 CNRS
超解像顕微鏡N-STORMは、ニコンの顕微鏡システムの中で最も高い解像度を達成し、落射蛍光顕微鏡に比べてXYZ解像度を約10倍まで向上することが可能です。N-STORMを搭載するための倒立顕微鏡Ti2-Eは、自動焦点維持装置パーフェクトフォーカスシステム(PFS)により、高い安定性を提供します。これにより、ZスタックSTORMモードにおける、軸方向の微細な制御が可能になり、最大5 µmの厚さの画像が取得できます。N-STORMを使用して、従来の全反射照明蛍光(TIRF)イメージングを行うことも可能です。
超解像共焦点レーザー顕微鏡システムAX/AX R with NSPARCは、広視野・高解像度・高速取得というAX/AX Rの特長を活かしながら、微細構造をより明るくシャープに観察できる共焦点システムです。NSPARCは、2次元に配列された25個のアレイディテクターにより、各スキャンポイントの空間情報を取得し、 XYZすべての方向で通常の共焦点画像よりも高い解像度と高S/N比を実現します。レゾナントスキャナーを使用すれば、高解像度でありながら高速な画像取得が可能となり、ライブセルイメージングやタイムラプス観察にも適しています。
●:使用可能 , ⚬:オプション
最大解像度 | ~20 nm (XY)* | 100 nm (XY) |
|---|---|---|
最大観察深度 | ~ 5 μm | ~ 100 – 500 μm |
画像取得速度 | ~0.1 FPS | ~15 FPS(ガルバノ、512 x 64 画素) |
対応波長数 | 3色 | 7色 |
最大画像取得範囲 | 80 x 80 μm | FN 25 |
使用可能な顕微鏡 | N-STORM | AX/AX R NSPARC |
倒立顕微鏡ECLIPSE Ti2-E | yes | yes |
正立顕微鏡ECLIPSE Ni-E | no | yes |
デジタル顕微鏡ECLIPSE Ji | no | yes |
AX NSPARCで撮影したミトコンドリア動態
超解像イメージングは、回折限界を超えて解像度を向上させることができますが、それぞれの技術に独自の制限やトレードオフがあります。そのため、どの技術が最も研究に適しているかを判断する際には、それらを十分に理解することが必要です。
一番重要な点は、超解像画像の取得速度が、一般的には従来の観察方法よりも遅いことです。N-STORMでのイメージングは取得速度が比較的遅いため、1枚あたり1秒以上かかることが多く、生細胞イメージングには不向きです。また、STORMなどのSMLM技術は、解像度を最大限に向上させることはできますが、使用できる蛍光色素が限られるため、使用する蛍光色素から選択することが必要です。
共焦点顕微鏡AX/AX Rに装着可能なNSPARCは、高解像度と高速取得を両立できます。また、使用できる蛍光色素や蛍光プローブの選択肢は広く、ライブセルイメージングにも適しています。
倒立顕微鏡Ti2-Eに搭載したニコンの電動補正環対物レンズ。
他のイメージング技術と同様に超解像イメージングにおいても、光学分解能を最大にするためには、対物レンズの選択が最も重要となります
高い開口数を有する、さまざまな液浸に対応した対物レンズを用意しています。ニコンの超解像顕微鏡用対物レンズには、CFI SR HP アポクロマート TIRF 100XC Oil (油浸、NA 1.49)や、 CFI SR HP プランアポクロマート Lambda S 100XC Sil (シリコーン浸、NA 1.35)、CFI SR プランアポクロマート IR 60XC WI (水浸、NA 1.27)などがあります。これらの対物レンズは、それぞれの液浸において最高レベルのNAを実現しています。
超解像顕微鏡用対物レンズの中には、電動補正環が使用でき、球面収差補正の微調整を電動で行えるものがあります。これにより、最高レベルの解像度と三次元イメージングを実現します。
蝸牛繊毛のポイントスキャン共焦点顕微鏡画像。高解像度機能適用前(左)と適用後(右)のXY画像とXZ画像
従来の共焦点顕微鏡を用いても、高解像度イメージングを実現することができます。共焦点顕微鏡は、ピンホールによって焦点面以外からの散乱光を除去することで、一般的な広視野顕微鏡より優れた解像度の画像を取得できます。さらに、ピンホールサイズの最適化と複数回の3Dデコンボリューションの実施により、最高140 nm(XY)の高解像度観察が可能となります。
一般的な蛍光色素が使用でき、操作も簡単なため、超解像イメージングほどの分解能を必要としない場合、手軽かつ実用的な選択肢となります。
ポイントスキャン共焦点レーザー顕微鏡システムAX/AX Rは、高解像度の共焦点イメージングが可能です。可視域から近赤外域の蛍光色素を検出できることと、4波長までの同時取得が可能であることが特長です。ピンホールは六角形で、サイズが連続的に可変のため、より精度の高い調整が可能です。AX Rのレゾナントスキャナーを使用すれば、高解像度でありながら、ビデオレート(30 FPS)以上の高速でイメージングすることができます。