アプリケーションノート

方法，結果，考察

長日条件下で生育したイネ（日本晴）から穂を採取し、4% (w/v)パラホルムアルデヒドで固定した。実体顕微鏡下で外穎・内穎を剥いで葯を取り出した後、0.01％ (v/v) SR2200（主に細胞壁を染める）ならびに0.1 µg/ml Propidium Iodide（核ならびに細胞壁を染色）で染色を行った。その後、ClearSee、ClearSeeAlpha（50 mM亜硫酸ナトリウム）、iTOMEI、RapiClear1.47、RapiClear1.52、 45% (v/v) RapiClear1.52 に２～３日浸漬することで透明化した。

今回試した透明化液では、ClearSee、ClearSeeAlpha、iTOMEIで、葯室の収縮のない良好な形の葯が得られた（表１）。透明化した葯は、当初53％（v/v）グリセリン水（屈折率1.41）で作成した１％アガロースジェルにマウントしたが、透明化した葯の色が元に戻る印象を受けた。そこでClearSeeAlphaならびにiTOMEIを固化することを目指し、いろいろな濃度のアガロースを加えたところ、 ClearSeeAlphaは2％(w/v)、iTOMEIでは1％(w/v)で柔らかめのジェルができることがわかった。

今回はシリコーンオイルの屈折率1.41に合わせ、 ClearSeeAlphaを固化したものでマウントした(図１a)。また ClearSeeAlphaアガロースに⌀100 nmの蛍光ビーズを混ぜ、40倍のシリコーン浸対物レンズを用いて、固化させたサンプル内のビーズにおける光軸方向のPSFを測定した（図１b）。これにより、観察する葯の各深さにおける収差がほぼ均一の状態であることを確認した。マウントした葯のサンプルは、25倍および40倍のシリコーン浸対物レンズを用いて共焦点レーザー顕微鏡システムAX Rで撮像した（図２）。取得した画像についてはデコンボリューション（Richardson-Lucy）処理を行った。

まとめ•展望

屈折率1.41のClearSeeAlphaで透明化したイネの葯を、この透明化液で作成したジェルでマウントし、シリコーン浸対物レンズを用いることで、屈折率の違いに起因する収差の影響をほぼ受けない観察を実施できた。Z方向についても200 µm程度まで、細胞レベルの精度の高い観察が可能となった。

このような観察は、パラフィンや樹脂で切片を作成する必要をなくし、発生や細胞分化の時空間的な解析を容易にする技術である。今後は、よりNAが高く解像力の優れたシリコーン浸対物レンズ を用いた深部細胞の細胞内構造の観察や、AI機能を搭載するソフトウェ。

機能を搭載するソフトウェアで得られた画像の解析により、細胞の形状や体積などの定量化が実現すると期待される。

謝辞

標本および画像をご提供いただきました、沖縄科学技術大学院大学サイエンス・テクノロジー・クループの小宮怜奈先生、同イメージングセクションの小泉好司先生に深謝いたします。

参考文献

Araki S, Le NT, Koizumi K, Villar-Briones A, Nonomura KI, Endo M, Inoue H, Saze H, Komiya R (2020). miR2118-dependent U-rich phasiRNA production in rice anther wall development. Nat Commun. 11: 3115.

Kurihara D, Mizuta Y, Nagahara S, Higashiyama T (2021). ClearSeeAlpha: Advanced Optical Clearing for Whole-Plant Imaging. Plant Cell Physiol. 62: 1302-1310.

Sakamoto Y, Ishimoto A, Sakai Y, Sato M, Nishihama R, Abe K, Sano Y, Furuichi T, Tsuji H, Kohchi T, Matsunaga S (2022). Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Commun Biol . 5: 12.