顕微鏡の観察法

また干渉とは、図2のように位相の異なる複数の波【①、②】を重ね合わせた波【③】が強めあったり【A、Cの状態】、弱めあったり【Bの状態】する性質を指します。

2.2 振幅物体と位相物体

光がある物体に入ると、物体内部で光が吸収されたりして光の振幅が変化し、人の目に明るさの差として感知されます。このように光の振幅に変化を与える物体を振幅物体（不透明な物体、染色した標本など）といいます。振幅物体は明視野観察により観察できます。明視野観察は図3のような構成で、簡単に説明すると、光源から出た光は試料面に到達し、回折されずに直進する直接光と、試料に当り回折した光とに分かれ、それぞれ対物レンズを通り対物レンズ後側焦点面に回折像が形成され、その後像面で干渉し像を作ります。このとき試料により光が吸収されているので、像に明暗や色調の変化が現れます。

これらのことから

結像光 = 直接光＋回折光

一方、ある物体に光が入ったとき、その光に位相変化を与える物体を位相物体（無色透明な標本、生体細胞、細菌など）といいます。人の目は、振幅が同じで位相のみが異なる光の差を感知することはできません。この位相の差を可視化して人間の目で感知できるようにした観察方法が位相差観察です。

2.3 位相差観察の原理

人間の目で感知できない位相の差を、どのように可視化するのでしょうか。まず、試料が位相物体であっても、振幅物体のときと同様に、試料に到達した光は試料のないところを通過した直接光と、試料に当り回折した光とに分かれます。従って

結像光 = 直接光＋回折光 ・・・・(1)

と表すことができます。

変形すると

回折光 = 結像光―直接光 ・・・・(2)

となります。

2.4 実際の顕微鏡の構成

次に、位相差観察における実際の構成を図7に示します。

1. 光源から出た光は、まずリング絞りによって絞られます。
2. コンデンサレンズを通り試料に到達します。
3. 試料に到達した光は、試料内部を直進した直接光と、位相物体により回折し曲がって進んだ回折光とに分かれます。回折現象は屈折率に違いのある部位で発生するので、回折光は微生物と溶液との境界部分、微生物の内部構造部等、観察位相物体の形状情報を含んでいます。
4. 標本の情報を持った回折光と直接光がそれぞれ、対物レンズを通り位相板に到達します。
5. 位相板は光の位相を1/4λずらす1/4波長板と、光を吸収するNDフィルターがリング状に形成されており、位相版以外の部分は透明になっています。直接光は対物レンズによって集光され、リング状の位相板のところを通過するため位相を1/4λずれると同時に明るさが弱められます。一方、回折光は大部分が位相板の透明なところを通過するため位相も明るさも変化しません。
6. 直接光と回折光は像面に到達して、明暗のコントラストがついた像として見えてきます。

アポディゼイション位相板の使用と従来との比較