顕微鏡の観察法

落射蛍光顕微鏡とは

落射蛍光顕微鏡とは上記の特性をもつ蛍光物質を観察するための顕微鏡になります。

光学系には、励起用の光源（一般的には水銀ランプ）と「フィルターキューブ」を有しており、フィルターキューブにより励起光と蛍光を分離しています。 そして、様々な蛍光物質に対応したフィルターキューブが準備されており、複数の蛍光物質で染色された試料などでもフィルターキューブを切替えながら連続的に観察することができるようになっています。

励起フィルター（Excitation filter：略称EX）

励起フィルターは、蛍光物質の励起に必要な波長の光を励起光源（一般には水銀ランプ）から抽出するための光学素子です。図2で示すように、特定の波長の光のみを透過し、それ以外の光を通さないようなバンドパスフィルターが一般的に用いられます。

ダイクロイックミラー（Dichroic mirror：略称DM）

ダイクロイックミラーは、励起光と蛍光を分離するための光学素子になります。ダイクロイックミラーは日常的な「鏡」とは異なり、特定の波長の光のみを反射し、それ以外の波長の光を透過するという特徴をもちます（図3）。落射蛍光顕微鏡のフィルターキューブにおいて用いられるダイクロイックミラーは特に入射光に対して45°で配置されたときに図のような「反射」「透過」帯域をもつものが使用されます。これにより励起フィルターを透過した光はダイクロイックミラーにより反射され（90°折り曲げられ）対物レンズ及び試料方向へ導かれます。さらに試料から発せられた蛍光は透過され、観察者（もしくはカメラ）方向へ進むことができるようになります。

吸収フィルター（Barrier filter または Emission filter：略称BA または EM）

吸収フィルターは、試料から発せられた蛍光とその他の不要な散乱光などを分離する光学素子となります。図4のようにダイクロイックミラーを透過した長波長の蛍光を透過し、その他の励起の漏れ光（試料や光学系からの散乱光）などは通さない働きをします（励起光に対する蛍光の強度比は100000:1以下と非常に小さい）。多くの吸収フィルターは、より良い蛍光画像を得られるように若干傾けて設置してあります（ゴーストの発生を抑えるため）。

上記、励起フィルタ、ダイクロックミラー、吸収フィルタの関係性を表すと図5のようになります。

ダイクロイックミラーの選択

蛍光物質の励起波長と蛍光波長を上手く分離できるような波長特性のミラーを選びます。具体的には、45度に傾けて測定したダイクロイックミラーの透過分光特性曲線と蛍光物質の波長特性を見比べながら、ダイクロイックミラーの透過帯域の立ち上がり波長が蛍光物質の励起波長と蛍光波長の間にくるようなものを選びます。

蛍光物質の、励起波長と蛍光波長が近い（ストークスシフト*1が小さい）場合にはできるだけ蛍光信号を透過させるために短波長寄りで立ち上がるダイクロイックミラーを選びます。ダイクロイックミラーは立ち上がり波長だけでなく立ち上がりの傾きも意識して選びましょう。立ち上がりが緩やかなダイクロイックミラーの場合、蛍光信号の透過率を下げてしまう場合があります。

*1: ストークスシフトとは：光で励起された物質中の電子が、励起状態遷移する前に周囲の原子との相互作用によってその励起エネルギーの一部を熱エネルギーなどの形で非放射的に失うことによる励起光と発光のエネルギー差。（理化学辞典:岩波新書）

励起フィルターの選択

蛍光物質の励起波長をできるだけ満たすようなフィルターを選びます。特に、水銀ランプを光源に利用する場合は水銀ランプの輝線を励起波長に取り入れることで効率のよい励起が可能となります。観察しようとする蛍光物質の励起波長以外の波長帯域に強い光を与えることは、背景光を上げ、試料に不必要なダメージを与えることになりますので、できるだけ避けましょう（図7の440nmなどは励起効率が低い）。