Focus On Super-Resolution

ニコンはさまざまなアプリケーションをサポートする、解像度向上技術にフォーカスします。

光学顕微鏡は、100年の長きにわたり、光の回折限界という制約のために、XY方向に約200nm(Z方向に約500nm)以下の詳細な構造は解像できませんでした。こうした限界を打破するために、数々の新技術が開発され、超解像顕微鏡の先駆者による2014年のノーベル化学賞受賞につながりました。現在では、構造化照明顕微鏡法(SIM)により、従来の2倍の解像度で、また、STORM法により、約10倍の解像度で画像取得が可能です。また、エアリーユニット以下のサイズを持つピンホールやデコンボリューションを使用することで、共焦点顕微鏡での観察においても解像度を向上することができます。ニコンは多彩な超解像技術をご提案し、高度な実験システムに応用することにより、さまざまな研究課題の解決にフォーカスします。

構造化照明顕微鏡法(SIM)

さまざまなサンプルに対応可能な、使いやすい超解像イメージング技術

構造化照明顕微鏡法(SIM)は、3次元解像度を落射蛍光顕微鏡の2倍に向上する革新的なイメージング技術です。構造化照明は、回折限界のサイズの、明暗ストライプの正弦波パターンを形成し、それを使用したサンプル面における光束干渉によって行います。パターンに含まれる空間周波数は、サンプル構造を構成するさまざまな周波数と混合します。つまり、顕微鏡の対応範囲を超える微細な空間周波数も、周波数の混合によって人工的に下位に変調できるため、後処理においてそれを間接的に検出して、復元することが可能です。SIMは、通常の落射蛍光顕微鏡のXYZ解像度を、2倍まで向上できます。

  • 超解像顕微鏡N-SIM Sは、空間光モジュレーター(SLM)を使用して構造化照明パターンを生成し、毎秒15フレームまでの高速取得を実現します。取得速度の向上は生細胞イメージングに特に有効なだけでなく、Zスタックなどの多次元取得に要する時間も短縮できます。N-SIM Sは、さまざまな対物レンズや浸液が使用でき、多色同時イメージングや3D-SIM・ 2D-SIM・TIRF SIMイメージングが可能です。
  • 超解像顕微鏡N-SIM Eは、N-SIM Sの分解能はそのままに、魅力的なコストでSIMを実現できます。単一の回折格子を使用した、3レーザー波長による3D-SIMイメージングが可能です。
  • N-SIMを利用したナノ粒子の反射光イメージングについては、アプリケーションノートをご参照ください。

STORM法(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)

解像度を限界まで向上する高度な超解像技術

STORM法(STochastic Optical Reconstruction Microscopy)は、一分子ローカリゼーションの概念を利用し、解像度を落射蛍光観察の約10倍まで向上することができます。さまざまな光化学技術により、サンプルを標識する蛍光分子の大部分を「スイッチオフ」することが可能です。少数の蛍光分子を一度に「スイッチオン」することで、発光現象の一つ一つが簡単に特定でき、それらの中心位置は統計的に回折限界以下のサイズの点に適合します。これにより、XY方向に約20nm、Z方向に70nmの解像度を得ることができます。STORMには、スイッチングを誘導する特殊なサンプル調整と緩衝システムが必要です。

  • 超解像顕微鏡N-STORMは、ニコン独自のパーフェクトフォーカスシステム(PFS)をベースにしたZスタックイメージングが行えるため、可変TIRF/斜光照明を使用してサンプルの5µm以上の深部イメージングが可能です。
  • CFI SR HP プランアポクロマート Lambda S 100XCシリコーン浸対物レンズ(NA 1.35)は、生細胞STORMイメージングや一分子イメージング実験における、水溶液中の球面収差が正確に補正できます。また、N-SIM Sを使用した、厚みのあるサンプルや生体試料のイメージングにも最適です。
  • N-STORMは、他のローカリゼーション法にも対応できます。N-STORMを使用したDNA-PAINT実験については、アプリケーションノートをご参照ください。

共焦点画像の解像度を向上するデコンボリューション

共焦点レーザー顕微鏡システムA1用のソフトウェアモジュールERにより、超解像に迫るイメージングが可能。

デコンボリューション解析が共焦点画像のS/N比や解像度の向上に有効であることはよく知られていますが、それが実際に日常的に利用されるようになったのはごく最近です。数年前までは、それほど大きくないサイズのデータでも、デコンボリューションの処理に一日がかりの時間を要したため、専門家以外にはあまり使われることがありませんでした。近年のコンピューターのアルゴリズムの改善とGPUの高速化により、デコンボリューションに要する時間は大幅に短縮され、ほぼすべてのイメージングワークフローに簡単に追加できるようになりました。ニコンの解像度向上ソフトウェアモジュールERは、CFIシリーズ対物レンズ用のPSF(ポイントスプレッドファンクション)モデルを使用した、ポイントスキャニング共焦点画像のデコンボリューション用アルゴリズムを搭載しています。

共焦点顕微鏡および超解像顕微鏡に関するサイエンスeBookをダウンロードいただくと、さらに詳しく知ることができます。

電動補正環対物レンズ

新しい目標は、敏感な超解像実験で球面収差を補正するために不可欠な自動補正カラーアライメントを備えています。

球面収差は、高分解能顕微鏡の性能を制限する光学収差の一つです。カバーガラスの厚さやサンプル溶液の屈折率のばらつきによる球面収差を補正するために、対物レンズの多くは補正環を搭載していますが、補正環の調節は(特に複数のサンプルの場合は)操作が面倒なうえ、最適な調整位置を確実に特定するのは困難です。超解像顕微鏡用のニコンの電動補正環シリーズ対物レンズは、NIS-Elementsソフトウェアの自動調節機能との組み合わせで、高度な球面収差補正を実現し、顕微鏡システムの分解能を最大限に引き出します。CFI SR HP Apo TIRF 100X Oil対物レンズとCFI SR Plan Apo IR 60X WI対物レンズに、電動補正環バージョンをご用意しています。

超解像イメージングに最適な、優れた安定性

パーフェクトフォーカスシステムを搭載した電動倒立顕微鏡エクリプスTi2-Eは、超解像イメージングに最適なプラットフォームです。

超解像の効果を最大限に得るには、システムの安定性を極限まで高めることが不可欠です。これまでの観察法では気づかないほどの軽微なフォーカスドリフトでも、超解像画像の性能を損なう原因となります。研究用倒立顕微鏡Ti2-Eは、コンピューター支援製造をベースにしたZフォーカス機構の搭載により、XYドリフトを低減し、高度な研究に安定性の高いプラットフォームを提供します。Ti2-Eはまた、業界をリードする焦点維持技術であるパーフェクトフォーカスシステムの最新世代(PFS4)を搭載。リニアエンコーダーと高速フィードバック機構により、温度変化や振動によるフォーカスドリフトを補正します。また、検出部をレボルバー部から分離するモジュラー設計を採用し、Zドライブ機構への負荷を低減。熱の発生をほぼ完全に抑え、非常に安定したイメージング環境を実現します。