Focus auf die Virologie

Eine große Auswahl von Nikon-Systemen ermöglicht die erfolgreiche Langzeit- und Zeitraffer-Bildaufzeichnung viraler Prozesse bei minimalem Photobleichen mit Hochgeschwindigkeits-Weitfeld- und konfokaler Mikroskopie, auf künstlicher Intelligenz (KI) basierender Softwaretechnologie sowie mit einem einzigartigen Echtzeitfokus-Haltesystem (Perfect Focus System, PFS).

Das inverse Großfeldmikroskop ECLIPSE Ti2 ist eine leistungsstarke Plattform für das Life Cell Imaging in der Virologie. Das unvergleichlich große Sehfeld von 25 mm erfasst Veränderungen und Reaktionen von Zellen und Viren gleichzeitig über relativ große Präparatbereiche (Gesichtsfeder F.O.V.). Das Perfect Focus System (PFS) verhindert selbst minimale Fokusdrift und hält bewegte Zellen und Viren stets im Fokus wodurch hochauflösendes Imaging mit hoher Geschwindigkeit und über lange Zeiträume in Top-Qualität realisierbar ist.

Die konfokalen Mikroskope AX/ AX R, CSU-W1 SoRa und Crest X-Light V3 verfügen über das große Seh-/Scanfeld (bis zu 25 mm), das fast doppelt so groß ist wie bei herkömmlichen konfokalen Mikroskopen. Dadurch können in einem einzigen Scan fast doppelt so große Präparatbereiche (Gesichtsfelder) erfasst werden, was zu erheblich höherer Effizienz der Bilddatenerfassung führt. Echtzeitbeobachtungen viraler Aktivitäten zusammen mit lebenden Zellen sind auch mit der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) möglich, deren Module geschickt in das inverse Mikroskop Ti2 integriert werden können. TIRF ermöglicht die Untersuchung von Prozessen in der Nähe der Zellmembran mit außergewöhnlich hohem Signal-Rausch-Verhältnis, wie z. B. dem Mechanismus des Viruseintritts in Zellen und dessen Auswirkungen auf Zell-Zell-Wechselwirkungen. Eine verbesserte Auflösung wird mit dem konfokalen System CSU-W1 SoRa-Spinning Disk durch das Konzept des "optical photon reassignment" erreicht. Das konfokale Spinning Disk-System Crest X-Light V3 bietet eine homogene Beleuchtung über ein großes Sehfeld von 25 mm.

Mit dem Hochgeschwindigkeits-Resonanzscanner des AX R können Phototoxizität und Ausbleichen von Fluoreszenzsonden, die zum Markieren von Viren verwendet werden, minimiert werden. Eine ganz besondere Eigenschaft des konfokalen Mikroskops AX R liegt in der Kombination des hochauflösenden High-Speed-Resonanzscanners mit dem großen Sehfeld von 25 mm. Dadurch wird der Durchsatz der Bildaufnahme nochmal erheblich erhöht. Und Nikon's einheitliche Softwareplattform NIS-Elements, die jetzt auch die auf Deep Learning basierenden NIS.ai unterstützt, darunter Clarify.ai, Denoise.ai und Enhance.ai steuert selbstverständlich auch die Live-Cell-Imaging Systeme von Nikon.

Clarify.ai entfernt automatisch Unschärfen aus Weitfeld-Fluoreszenzbildern mithilfe eines vortrainierten neuronalen Netzwerks. Denoise.ai entfernt das Poisson'sche Schrotrauschen aus konfokalen Bildern mit dem High-Speed Resonanzscanner, entweder in Echtzeit oder nach der Bildaufzeichnung, und verwendet auch ein vorab trainiertes neuronales Netzwerk. Deshalb kann man mit dem konfokalen Mikroskop AX R in Kombination mit der Software Denoise.ai Bilder mit sehr hohen Geschwindigkeiten von Strukturen mit schwachen Signalen aufnehmen, für deren ausreichend aufgelöste Darstellung normalerweise Scanningvorgänge mit deutlich längeren Pixel-Verweilzeiten erforderlich wären. Enhance.ai ist nützlich für die Darstellung von Viren bei extrem gering dosiertem Anregungslicht, welches dann erforderlich ist, wenn sehr lichtempfindliche Markierungssubstanzen, noch darüber hinaus in geringen Konzentrationen eingesetzt werden. Das entsprechende neuronale Netzwerk wird unter Verwendung aufeinander abgestimmter Bilddaten - aufgenommen mit hohem und mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis - trainiert, wodurch Enhance.ai dann schnell die Bilderresultate mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis aus den Bildern mit der tatsächlich benutzten, schwach dosierten Anregungsenergie vorhersagen und darstellen kann.

Der Transport und die Ausbreitung des Alphaherpes-Virus in neuronalen Kulturen wurde von Dr. Lynn Enquists Team an der Princeton University, USA, unter Verwendung einer Nikon-Weitfeld-Imaging-Plattform (inverses Mikroskop Eclipse Ti mit Steuerung durch NIS-Elements software) untersucht. Ihre Arbeit wendet Live Cell Imaging in Echtzeit- und mit Zeitrafferaufnahmen (über Nacht) von Viren an, die fluoreszierende Proteinverbindungen exprimieren, um Anordnungsmuster von Viren während der Infektion von primären Neuronen zu untersuchen. Durch ihren Ansatz wird auch der Einfluss des Fluoreszenzanregungslichts auf die Viren minimiert.

(Taylor, M.P. et al. (2013) J. Vis. Exp. (78), e50723, doi:10.3791/50723).

Bei umfangreichen klinischen Screenings, wie z.B. Arzneimittel- und Virustests, wird in relativ kurzer Zeit eine beträchtliche Menge mehrdimensionaler Bilddaten erstellt. Nikon bietet eine High-Content-Cell-Screening-Plattform (LIPSI), ein grafisch unterstütztes Programmiertool (JOBS) und eine leistungsstarke Analysesoftware (GA3) zur Optimierung und Steuerung automatisierter Workflows, die eine zuverlässige Darstellung von Virusaktivitäten bei hohem Bildaufnahmedurchsatz ermöglichen.

Nikon's High-Content Zell-Screening-Plattform, LIPSI, bietet eine hervorragende Lösung für das vollautomatisierte Durchmustern von lebenden Zellen in multiplen Mikrotiterplatten. LIPSI nutzt uneingeschränkt die Flexibilität und Leistungsstärke des inversen Forschungsmikroskops Eclipse Ti und bietet eine Roboterautomatisierung für ein schnelles Screening mit hohem Probendurchsatz für Zellkulturplatten mit bis zu 20 wells!

Das Modulpaket General Analysis 3 (GA3) führt umfangreiche Nachbearbeitungen mit AI-basierten Segmentierungstools zu komplexen Analyse-Pipelines in einfachen Schritten zusammen. Die in jedem Bild enthaltenen Bilderfassungsparameter und Analyseergebnisse können leicht mit anderen Parametern verknüpft werden, z. B. Umgebungsbedingungen, die für Studien an Viren von entscheidender Bedeutung sein können.

Zusätzlich zu den schier endlosen Bildverabeitungs- und Bildanalysefunktionen in der Software-Reihe NIS-Elements kann man mit JOBS maßgeschneiderte Versuchsprotokolle erstellen. Diese können mit vollautomatischer Bildakquisition und -analyse und multiplen Zellkultur-Platten ausgeführt werden. Dies beinhaltet den Echtzeit-Zugriff auf Messdaten - well für well -, sowie diverse "heat-map"-Trenddarstellungen und weitergehende Analysen. Mit den AI-Modulen von NIS-Elements wie Convert.ai und Segment.ai kann sowohl die Schonung der lebenden Zellen als auch der Durchsatz der Bildaufnahmen erhöht werden, wobei die neuronalen Netzwerke trainiert werden können, um die Bilder zu klassifizieren und die interessierenden Strukturen zu identifizieren und zu segmentieren. JOBS kann die gesamte Imaging-Plattform rationalisieren und automatisieren und Funktionen wie Gerätesteuerung, Bildaufnahme, -verarbeitung, -analyse und -berechnung integrieren, ohne dass weitreichende Programmierkenntnisse erforderlich sind.

Die Forschungsgruppe von Dr. Vibor Laketa an der Universität Heidelberg hat kürzlich einen semi-quantitativen SARS-CoV-2-Antikörpertest zur Verwendung an Humanseren entwickelt. Dieser Mikroskop basierte Test wird mit einem Nikon ECLIPSE Ti2 -Weitfeldmikroskop verifiziert, das über das JOBS-Modul in der NIS-Elements-Software gesteuert wird, um automatisch Bilder in 96-Well-Platten aufzuzeichnen. Dieser neue Test zeigt eine verbesserte Empfindlichkeit und Spezifität im Vergleich zu einem Standard-ELISA-basierten Diagnosetest und schafft einen hohen Probendurchsatz, der für große Screening-Programme erforderlich ist.

(Pape, C. et al. (2020) bioRxiv (preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.15.152587)).

Super-Resolution-Mikroskopie viraler Struktur und Aktivität

Virale Partikel variieren stark in ihrer Größe mit Durchmessern von ungefähr 5 bis 300 nm, was von jenseits bis nahe an die Auflösungsgrenze der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie reicht. Seit Hunderten von Jahren konnte die optische Mikroskopie nur zelluläre Details in XY von ungefähr 200 nm und in Z von 500 nm auflösen. Aber neue Super-Resolution-Techniken waren erfolgreich darin, biologische Details in XY von bis zu ungefähr 20 nm und in Z von bis zu ca. 50 nm aufzulösen. Dies ermöglicht die Untersuchung kleiner und manchmal relativ rar verteilter Mikroorganismen (einschließlich Viren) mit Strukturdetails bis fast auf molekularer Ebene. Diese hochauflösenden Techniken helfen dabei, die Lücke zwischen konventioneller Fluoreszenzmikroskopie und der Elektronenmikroskopie zu schließen.

Nikon bietet eine Reihe von Super-Resolution-Systemen für verschiedene Imaginganwendungen. Die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) bietet die doppelte Auflösung eines typischen Weitfeldmikroskops in X, Y und Z bei gleichzeitig relativ hoher Bildaufnahmegeschwindigkeit und ziemlich flexiblen Anforderungen an die Probenvorbereitung. Die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) bietet die beste Auflösung - bis zu 10-mal höher als herkömmliche lichtmikroskopische Techniken.

SIM verwendet das Konzept einer Frequenzüberlagerung, um hochauflösende Frequenzinformationen im Bild zu identifizieren und mathematisch zu restaurieren. Dies funktioniert, indem die Probe mit geeigneten Streifenmustern bekannter, hoher räumlicher Frequenz in verschiedenen Orientierungen beleuchtet wird. Die bekannten hohen Beleuchtungsfrequenzen interferieren mit den unbekannten hohen Frequenzen in der Probe zu sog. Moiré-Bildern. Diese können durch das Objektiv umfänglich aufgelöst und dargestellt und einer mathematischen Analyse zugeführt werden. Dadurch werden die hochaufgelösten Frequenzinformationen ermittelt und zur Berechnung des endgültigen Bildes mitverwendet. Die Aufnahmegeschwindigkeit mit dem System N-SIM S beträgt bis zu 15 Bilder pro Sekunde. Dies wird durch die Verwendung eines Spatial Light Modulators (SLM) zur Mustermodulation ermöglicht und ist besonders nützlich, um z.B. das schnelle Fortschreiten von Virusaktivitäten in lebenden Zellen zu visualisieren. Das N-SIM S kann auf einem konfokalen Mikroskop-System implementiert werden. Ein solcher korrelativer Methodenansatz ermöglicht im ersten Schritt die relativ schnelle konfokale Bildakquisition über große Gesichtsfelder, und im zweiten Schritt die Detaildarstellungen mit Super-Resolution in definierbaren, interessierenden Sub-Regionen.

Das Super-Resolution-System N-STORM überschreitet die Grenzen der optischen Auflösung, indem immer nur eine vergleichsweise kleine Anzahl der ("photo-switchable") Fluorophore in einer Probe zum Fluoreszieren gebracht („angeschaltet“) wird. Von jedem dieser stochastisch aufscheinenden Emissionsereignisse (=Beugungsscheibchen) wird mit hoher Präzision die Schwerpunktposition (per Gauß-Fit) ermittelt und als Punkt gespeichert. Durch das Wiederholen dieser Zyklen in geeigneter Zahl (z.T. mehrere 1.000 Mal) kann das gesamte Bild mit einer beispiellosen Auflösung auf ungefähr 20 nm in XY- und 70 nm-Richtung in Z-Richtung rekonstruiert werden. Denn jedes Fluorochrom trägt als Punkt zum Bild bei, nahezu egal, wie dicht die ursprünglichen Emissionsereignisse beieinander lagen. Nikon's Silikon-Immersionsobjektiv 100 X (NA = 1,35) ermöglicht eine ausgesprochen gute räumliche Abbildungsleistung feinster Strukturen in lebenden Zellkulturen und dickeren 3D-Proben, da es die sphärische Aberration in wässrigen Medien exzellent korrigiert.

Wie bei allen Nikon-Mikroskopen ist auch bei seinen Super-Resolution-Systemen die Software NIS-Elements für die erfolgreiche Bilderaufnahme von grundlegender Bedeutung und vereinfacht die Akquisition und Analyse auch der Super-Resolution-Bilder erheblich.

Das Nikon Center of Excellence (CoE) am the Heinrich Pette Institute (HPI) in Hamburg ist ein Zentrum für Forschung und Lehre zu den Grundlagen und Fortschritten der Mikroskopie für die Untersuchung humanpathogener Viren. Eine Studie am HPI konnte die Eignung der Multicolor-3D-STORM-Technologie für hochauflösendes Imaging von Hepatitis-C-Virus (HCV) -Infektionen zeigen. STORM ermöglichte die Visualisierung der räumlichen Verteilung des Strukturkerns und des E2-Hüllproteins von HCV in kleinen Lipidtröpfchen an der Membran des endoplasmatischen Retikulums in infizierten Zellen. Diese Bereiche der Co-Lokalisierung haben einen Durchmesser von ungefähr 100 nm und es wird angenommen, dass sie Orte des viralen Assemblings darstellen.

(Eggert, D. et al. (2014) PloS ONE 9(7): e102511. Doi:10.1371/journal.pone.0102511).