Intravitalmikroskopie an ganzen Geweben und Tieren

Das Hineinfokussieren in tiefere Schichten ganzer Organismen, Organe und Gewebe ist eine der größten Herausforderungen an die Lichtmikroskopie. Biologische Proben sind optisch nicht gerade ideale Medien – sie streuen sowohl das Beleuchtungs- als auch das Detektionslicht. Streuung und verschiedene optische Aberrationen werden mit zunehmender Tiefe in der Probe graduell schlimmer, was letztendlich eine praktische Grenze für die erreichbare Abbildungstiefe („Deep Imaging“) auferlegt.

Produkte für die Mikroskopie an ganzen Organismen und Geweben

**Zebrafischembryo**

Objektiv 20X LWD, NA 1,0, WD 2,8 mm. Mit freundlicher Genehmigung von Erika Driekorn und Dr. Beth Roman, Department of Human Genetics, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health.

Nikons führende Lösung für das Mikroskopieren in tieferen Probenschichten ist das Multiphotonen-Mikroskopsystem AX R MP. Es unterstützt Anregungswellenlängen von bis zu 1300 nm, was gute Bilder in einer Tiefe von bis zu 1,4 mm in der Probe erzeugt. Es ist auch möglich, gleichzeitig mit zwei Laser-Strahlen zu scannen, was die Multiphotonen-Mikroskopie mit mehrfach- Markierungen erlaubt.

Für Aufnahmen in Tiefen von bis zu einigen hundert Mikrometern (µm) in der Probe bietet Nikon das konfokale Mikroskopsystem AX / AX R an. Die konfokale Detektion mit einem einzelnen Pinhole, wie beim AX / AX R, ermöglicht im Vergleich zu konfokalen Systemen, die Arrays multipler Lochblenden verwenden, eine stärkere Unterdrückung des Lichts von außerhalb der Fokusebene und eine bessere Qualität der optischen Schnitte.

Das konfokale Spinning-Disk-System CSU-W1 von Yokogawa ist im Vergleich zu den meisten anderen Spinning-Disk-Systemen für die konfokale Mikroskopie an größeren Proben optimiert. Die Lochblenden in seinen Spinning Disks haben einen größeren Abstand voneinander, wodurch Crosstalk zwischen den Lochblenden reduziert wird – eine nützliche Funktion für das Imaging in tieferen Schichten in der Probe.

●: enthalten, ⚬: option

Kompatible Mikroskopstative	AX R MP	AX / AX R	CSU-W1
	AX R MP Multiphotonen-Mikroskopsystem	AX / AX R Konfokales Mikroskopsystem	CSU-W1 Konfokaler Spinning-Disk-Scanner
Sehfeld	22 mm Diagonale (quadratisch)	25 mm Diagonale (quadratisch)	17 x 16 mm (rechteckig)
Grenzbereich für das Imaging in tieferen Schichten	~ 1,4 mm (bei Anregung mit 1300 nm)	~ 100 – 500 μm	~ 50 – 100 μm
Unterstützt Imaging mit Video-Rate	Ja (30 FPS mit 512 x 512 Scan)	Ja (30 FPS mit 512 x 512 Scan; nur AX R)	Ja (limitiert durch das jeweilige Kamerasystem und die Rotationsgeschwindigkeit der Spinning Disks)
Optionen für die Detektoren	GaAsP Non-Descanned Detektoren (NDDs), bis zu 4 Kanäle.	GaAsP- kombiniert mit Multi-Alkali-Photomultiplier-Röhren (PMT)-Detektoren sind erhältlich. Bis zu 4 Kanäle.	Monochrome sCMOS- oder EM-CCD-Kameras empfohlen. Optionen für die Montage mehrerer Kameras und Kamerasplitter verfügbar.
ECLIPSE Ti2-E Invers	yes	yes	yes
ECLIPSE Ti2-A Invers	no	no	yes
ECLIPSE Ti2-U Invers	no	no	yes
ECLIPSE Ni-E Aufrecht	no	yes	yes
ECLIPSE Ni-U Aufrecht	no	no	yes
FN1 Aufrecht	no	yes	yes
AX-FNGP Aufrecht	yes	no	no
AX-FNSP Aufrecht	yes	no	no

Diskussion: Mikroskopie an ganzen Organismen und Geweben

Schaltkreise im auditorischen Hirnstamm eines Kükens. Gewebeklärung nach CUBIC-Protokoll (E17). Farbstoff: Tetbow (Tetracyclin-Transaktivator Brainbow). Objektiv CFI Plan Apochromat 10XC Glyc. Dr. Ryo Egawa, Dr. Hiroshi Kuba, Zellphysiologie, Graduiertenschule für Medizin der Universität Nagoya

Gewebe-Clearing und kompatible Objektive

Das Wiederaufgreifen der Methoden des optischen Clearings zur Erhöhung der Transparenz biologischer Gewebe hat es ermöglicht, größere und komplexere Proben mit viel besserer Qualität zu mikroskopieren. Dementsprechend werden durch diese Methoden der Probenvorbereitung für die Verbesserung der Mikroskopie mit höchstmöglicher Auflösung auch die physikalischen Ausmaße der Proben erhöht, in der Regel um einen Faktor von ~4 – 10X oder sogar mehr, und deshalb erfordern sie auch Mikroskop-Systeme, die für die Bildgebung in tiefen Probenschichten geeignet sind.

Bei der Mikroskopie dickerer Proben ist es von größter Bedeutung, den Unterschied zwischen dem Brechungsindex der Probe und dem des Immersionsmediums zu minimieren, um sphärische Aberration bestmöglich zu reduzieren, welche die Bildqualität und den nutzbaren Arbeitsabstand einschränkt. Nikon bietet Objektive für die Mikroskopie von geklärten Proben an, die jeweils direkt in verschiedene Klärmedien eingetaucht werden können und Korrekturringe für den Brechungsindex (RI) haben. Diese Objektive zeichnen sich außerdem durch lange Arbeitsabstände, hohe numerische Aperturen und mehr aus.

Nikon produziert auch Objektiv-Reihen mit Silicon-Immersion, CFI75 Wasser-Eintauchimmersion und Lambda S (diese Objektiv-Reihe umfasst mehrere Wasserimmersionsobjektive). Objektive, die mit Silikon, Wasser und Glyzerin immergiert werden können, lassen sich im Allgemeinen leichter mit üblichen Clearing- und Einbettmedien kombinieren, die vorwiegend einen Brechungsindex haben, der kleiner als Öl, aber größer als Luft ist.

Intravitalmikroskopie einer anästhesierten YFP-H-Maus (Alter 4 Wochen, Methode offener Schädel). Visualisierung der gesamten Pyramidenneuronen der Schicht V und der tieferen Hippocampusneuronen. Deep Imaging für die 3-dimensionale Darstellung von Hippocampus-Dendriten bis zu 1,4 mm tief im Gehirn.

Aufgenommen mit Objektiv CFI75 Apochromat 25XC W 1300 (NA 1,10, WD 2,0 mm) und mit episkopischem GaAsP NDD (Non Descanned Detector) für 1300 nm, Anregungswellenlänge: 1040 nm

Aufnahme in Zusammenarbeit mit: Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi und Tomomi Nemoto, Forschungsinstitut für elektronische Wissenschaft, Universität Hokkaido

Beleuchtungsstrategien für eine tiefere Bildgebung („Deep Imaging“)

Um gute Bilder aus tieferen Schichten einer Probe zu machen gibt es Strategien, die über bloße optische Raumfilter, wie bei einem konfokalen Mikroskop hinausgehen. Ein Ansatz, der auf jedem Fluoreszenzmikroskop implementiert werden kann, besteht darin, Fluoreszenzmarker mit stärker ins Rot verschobenen Anregungs- und Emissionsspektren zu verwenden. Licht mit längerer Wellenlänge wird weniger gestreut und eignet sich daher für die Bildgebung in tiefen Schichten. Das Imaging im Tiefrot- und im nahen Infrarot-Bereich (NIR) des Spektrums ist sowohl mit den konfokalen Mikroskopen der AX / AX R- als auch der Serie CSU-W1 möglich.

Die Vorteile der Beleuchtung mit Licht längerer Wellenlängen werden noch verstärkt, wenn sie mit der Multiphotonenanregung kombiniert werden – dem Prozess, bei dem ein Fluorophor, welches normalerweise von einem Photon einer bestimmten Energie/Wellenlänge angeregt wird, stattdessen von zwei oder mehr langwelligeren Photonen mit ähnlicher Gesamtenergie angeregt werden kann. Dieser Prozess kommt in der Natur so gut wie nicht vor, da die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Photonen mit der richtigen Energie fast im selben Moment von einem Fluorophor absorbiert werden, extrem gering ist.

In der Praxis erfordert das Erreichen einer Multiphotonenanregung einen sehr leistungsstarken gepulsten Femtosekundenlaser, und selbst dann ist die Leistungsdichte für eine Fluoreszenzanregung nur im Fokus des Laserstrahls hoch genug. Dadurch wiederum entsteht so gut wie keine Fluoreszenzanregung außerhalb der Fokusebene und es ist mehr oder weniger keine Lochblende (Pinhole) notwendig, um Emissionslicht von außerhalb der Fokusebene weg zu filtern. Während ein Pinhole immer noch zur Verbesserung des optischen Schnittbildes beitragen könnte, ist es auf der anderen Seite viel effizienter, stattdessen das detektierte Fluoreszenzsignal zu maximieren, da Streuung (in der Probe) und andere Probleme bei der Signalausbeute bestehen bleiben.

Glossar

Grenzbereich für das Imaging in tieferen Schichten: Das ist die ungefähre Distanz entlang der Z-Achse, über die das jeweilige System mit dem Objektiv in tiefere Schichten der Probe „Hineinfokussieren“ kann, um noch optische Schnitt-Bilder mit angemessener Qualität und ausreichendem Signal-Rausch-Verhältnis zu liefern. Dieser Wert kann sehr variabel sein und hängt stark von den optischen Eigenschaften der Probe, der Art der Probenkammer sowie der (Fluoreszenz-) Färbung ab.
Kompatible Mikroskopstative: Dies bezieht sich auf die Nikon-Mikroskopstativmodelle, die mit jedem System kompatibel sind.
Optionen für die Detektoren: Für Multiphotonen- und konfokale Systeme mit Punkt-Scannern werden im Allgemeinen Einzelelementdetektoren, wie z. B. Photomultiplier-Röhren (PMTs) verwendet. Für konfokale Systeme mit Spinning Disks und für Weitfeld-Mikroskope werden hingegen Digitalkameras verwendet.
Sehfeld: Das Sehfeld eines Mikroskop-Systems, auch mit Sehfeldzahl bezeichnet ist der Durchmesser (in mm) des reellen Zwischenbildes („imaging area“) bei einer nominalen Vergrößerung von 1x.
Unterstützt Imaging mit Video-Rate: Als „Video-Rate“ wird traditionell eine Aufnahmegeschwindigkeit von etwa 30 Bildern pro Sekunde (FPS) definiert. Die optimale Bildrate hängt von der genauen Anwendung ab und kann schneller oder langsamer als 30 FPS sein. EM-CCD-Kameras können typischerweise Bilder mit bis zu 60 FPS (Vollbild) und sCMOS-Kameras mit bis zu 40-100 FPS (Vollbild) aufnehmen.