近年の電子顕微鏡技術の発達により、細胞内小器官（オルガネ ラ）はそれぞれ独立に存在するのではなく、互いに5-30 nmまで近接 したオルガネラ間接触場を形成することが明らかになっている。その中で もミトコンドリアと小胞体が形成する接触場であるMERCSは、酵母から 哺乳類までよく保存された構造であり、脂質の生合成、Ca2+イオン制 御、様々な代謝物の輸送といった重要な細胞内反応場として機能す る。 哺乳類細胞においては、小胞体膜に局在するタンパク質PDZD8 がMERCS形成に必須の役割を担うことが明らかになっている (Hirabayashi, et al., Science, 2017)。

しかしながら、PDZD8と結合するミトコンドリア側のタンパク質は不明 であり、MERCS形成を担う分子メカニズムの全貌は明らかになっていな かった。青山先生らは本研究において、PDZD8と直接結合して MERCS形成を担うミトコンドリア分子の候補として、FKBP8を見出した。

さらに電顕を用いた解析から、PDZD8とFKBP8が同じ経路でMERCS 形成に必須の役割を果たすことを示した（図1）。

本実験では、FKBP8がPDZD8と直接結合するなら、FKBP8をミトコンドリア外膜に過剰発現させた時にPDZD8がミトコンドリア近傍に集積するのではないかと考え、この可能性について3D CLEMを用いた検証を行なった。

PDZD8がノックインされたHeLa細胞に対して、ミトコンドリア外膜に局在する変異型FKBP8を過剰発現させ、PDZD8を蛍光標識した。細胞を固定後、AX with NSPARCで蛍光観察し、その後同じ領域を電顕切片化して、電界放出型走査電子顕微鏡 (JSM-IT800, 日本電子) を用いて連続切片の電顕画像を取得した（3D CLEM、詳細は後述）。

電顕画像からミトコンドリア外膜と、MERCS（ミトコンドリア外膜から25 nm以内にある小胞体膜）をセグメンテーションして三次元再構築したところ （図2の上中央）、50 nm厚の連続切片8枚分（合計400 nmの厚さ）のミトコンドリア再構築像が、AX with NSPARCで取得したミトコンドリアシグナル(Venus-FKBP8)とほぼ一致した（図2の黄と緑）。すなわち、蛍光観察した領域を電顕画像内で再同定する ことができた 。

蛍光顕微鏡では、蛍光標識したタンパク質の局在は観察できるが、MERCSのようなナノスケール構造は直接観察できず、解像度も不足している。したがって、タンパク質のMERCS局在を明らかにするためには蛍光顕微鏡法と電顕法を組み合わせるCLEM法が必要となる。

この研究においては、PDZD8タンパク質を蛍光観察した後に同じ視野を電顕で観察してMERCSの位置を特定した。特に、高解像な蛍光像を取得するためにNikon AX with NSPARCを用い、対応する領域を三次元電顕法でイメージングして相関させる三次元CLEM (3D CLEM) を用いた（図5）。

3D CLEMを行う際、電子顕微鏡と蛍光顕微鏡の解像度があまりに大きく乖離していると、電顕画像で蛍光画像の光学的断面(Optical section)を全てカバーすることが難しくなるほか、2つの手法の画像の合わせ込みも難しくなる。

Nikon AX with NSPARCを用いることで、従来の共焦点顕微鏡に比べて高い解像度で蛍光画像を取得できた結果、電顕においては最小限の連続切片の取得で蛍光像と重ね合わせることが可能となった。この手法を用いることにより、MERCSという微細構造とPDZD8由来の蛍光シグナルが重なる様子を三次元で捉えることができた。