Imaging cellulare dal vivo

L'arte e la scienza dell'imaging cellulare vivo

L'imaging delle cellule vive richiede agli utenti di bilanciare attentamente le condizioni di imaging: l'obiettivo è raccogliere i dati essenziali minimi, che riducono al minimo la perturbazione del sistema modello. Sebbene si possa essere tentati di utilizzare una maggiore potenza di illuminazione, esposizioni della fotocamera più lunghe, ecc. per ottenere immagini con un rapporto segnale-rumore (SNR) più elevato, è importante capire che la fototossicità può compromettere l'integrità fisiologica e la continua vitalità del sistema. Inoltre, il fotobleaching impone un limite pratico al numero di fotoni che possono essere estratti da ciascun fluoroforo nel corso dell'esperimento.

Un altro fattore da considerare è la scelta dell'obiettivo. Le lenti dell'obiettivo ad olio ad alta apertura numerica (NA) possono funzionare bene per le funzioni di imaging vicino al vetrino coprioggetto in cellule piatte, ma soffrono di aberrazione sferica quando si fa imaging più a fondo nel campione campione. Ciò è dovuto al minor indice di rifrazione (RI) della cellula/mezzo di coltura rispetto al vetro/olio. Per applicazioni di imaging 3D e più profonde, si consiglia di utilizzare obiettivi che utilizzano supporti di immersione che corrispondono più strettamente al RI dell'ambiente di imaging, come acqua o silicone.

La serie di obiettivi CFI Apochromat Lambda S include una serie di obiettivi per immersione in acqua, incluso il CFI Plan Apochromat IR 60XC WI, che con NA = 1,27 ha il NA più alto per un obiettivo a immersione in acqua a di cui siamo a conoscenza. Nikon ha recentemente introdotto gli obiettivi della serie Silicone Immersion. Il silicone ha un RI di circa 1,4, che corrisponde più strettamente all'ambiente cellulare pur consentendo NA più elevati rispetto all'immersione in acqua. Questi obiettivi sono adatti per l'imaging di sistemi di coltura 3D come gli organoidi.

Ridurre al minimo la fototossicità e il fotosbiancamento nelle cellule vive

L'intensa irradiazione richiesta dalle tecniche di imaging basate sulla fluorescenza è intrinsecamente dannosa per la salute delle cellule, specialmente con lunghezze d'onda a più alta energia (spostate verso il blu). Per questo motivo, si raccomanda l'uso di fluorofori da rosso a vicino infrarosso, sebbene l'uso continuato di popolari fluorofori verdi come EGFP non sia eccessivamente proibitivo e continui a funzionare bene per molte applicazioni di imaging multicolori.

La maggior parte dei microscopi utilizza l'attivazione del software dei dispositivi di sistema. Tuttavia, questo può essere alquanto lento a causa della relativa imprecisione dell'orologio del computer e dei controlli e delle richiamate richiesti degli stati del dispositivo. Al contrario, l'attivazione hardware utilizza il pixel clock della fotocamera ad alta precisione per coordinare i dispositivi bypassando i callback dei dispositivi, massimizzando così la velocità del sistema e riducendo al minimo la dose di fotoni. I dispositivi attivati possono includere stadi piezoelettrici Z, illuminatori laser/LED e persino dispositivi personalizzati con capacità di comunicazione I/O.

L'attivazione consente anche schemi di illuminazione più complessi. Ad esempio, è possibile utilizzare il software Nikon NIS-Elements per illuminare il campione solo quando tutti i pixel di una fotocamera sCMOS sono esposti (tenendo conto dell'effetto del rolling shutter), riducendo la dose di fotoni e il fotosbiancamento rispetto all'illuminazione continua e al in esecuzione l'acquisizione di immagini. È anche possibile pulsare l'illuminazione sulla scala temporale del microsecondo durante l'esposizione con vari illuminatori LED e laser. L'illuminazione pulsata su questa scala temporale consente ai fluorofori eccitati in uno stato di tripletta più tempo per rilassarsi allo stato fondamentale e quindi aiutare a evitare i principali percorsi di photobleaching.

Utilizzo dell'intelligenza artificiale basata sul deep learning per migliorare l'imaging di cellule vive

L'avvento dei metodi di intelligenza artificiale (AI) per la microscopia ha aperto nuove possibilità per l'imaging di cellule vive con una dose ridotta di fotoni. I metodi basati sul deep learning si stanno rivelando adatti per saggi basati su immagini di campioni biologici. Nikon è impegnata nello sviluppo di soluzioni software stabili basate sul deep learning per varie applicazioni, disponibili come moduli NIS.ai per il nostro software NIS-Elements.

Clarify.ai fornisce la rimozione automatica della sfocatura dalle immagini a fluorescenza a campo ampio standard. Questo modulo è pre-addestrato di fabbrica e non richiede la regolazione manuale dell'immagine finale basata sull'utente, eliminando l'opportunità di soggettività. Clarify.ai consente quindi di eseguire il sezionamento ottico su immagini a campio ampio a piano singolo acquisite alla massima velocità di sistema, non richiedendo dati da più piani come con la deconvoluzione iterativa 3D di dati widefield.

Denoise.ai è un altro modulo pre-addestrato e utilizzato per rimuovere in tempo reale il rumore di Poisson (rumore dello scatto) dalle immagini confocali. Ciò consente tempi di esposizione ridotti ed è vantaggioso se utilizzato in combinazione con immagini di scansione risonanti acquisite utilizzando il microscopio confocale AX R, dove il rumore dello scatto è la fonte di rumore predominante.

Nikon offre anche il modulo Convert.ai per la previsione delle caratteristiche dell'immagine che vengono generalmente rilevate in un canale di fluorescenza, con il segnale previsto basato su un'immagine in campo chiaro corrispondente (ad esempio, la previsione dei pattern di colorazione nucleare DAPI dai dati dell'immagine DIC). Ciò consente l'eliminazione dei canali di imaging a fluorescenza, evitando l'illuminazione intensa richiesta dalle tecniche di fluorescenza. Le tecniche di imaging in campo chiaro sono intrinsecamente meno fototossiche.

Enhance.ai può essere addestrato per prevedere i dettagli nelle immagini a basso segnale-rumore (SNR), migliorando efficacemente l'SNR e consentendo l'imaging con dose di fotoni ridotta e fotobleaching.

Quale tecnica di contrasto è giusta per la tua ricerca?

Per campioni bidimensionali relativamente piatti, come cellule aderenti coltivate in vitro, l'imaging a fluorescenza ad ampio campo può essere sufficiente. I casi d'uso e i tipi di campione compatibili sono molto più ampi quando si combinano l'imaging a campo largo con l'analisi di deconvoluzione o la sfocatura automatica utilizzando il modulo software Clarify.ai.

L'imaging confocale diventa necessario quando si visualizzano campioni di spessore superiore a ~20 μm, ma sono utili anche per l'imaging ad alta risoluzione di campioni anche di pochi μm di spessore. Gli strumenti confocali a disco rotante sono veloci e adatti a campioni fino a ~50 μm (con il CSU-W1 in grado di acquisire immagini più profonde rispetto ad altri modelli grazie alla maggiore spaziatura tra i fori stenopeici). Entrambi i sistemi sono applicabili all'imaging di diversi tipi di sistemi di coltura cellulare 3D, come organoidi e sferoidi.

L'imaging confocale a point-scanning è in grado di acquisire immagini più profonde, fino a diverse centinaia di μm. Lo scanner risonante presente sul confocale AX R è in grado di fornire immagini della velocità video ed è concepito per la combinazione con Denoise.ai per la rimozione del rumore di ripresa in tempo reale. A differenza dei sistemi a disco rotante, l'AX R è dotato di un pinhole regolabile in modo continuo per l'ottimizzazione del sezionamento ottico e della risoluzione con qualsiasi obiettivo compatibile.

L'imaging a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) è una tecnica di sezionamento ottico che consente l'osservazione esclusiva delle caratteristiche cellulari che si verificano entro poche centinaia di nm dall'interfaccia cellula-vetrino. Ciò fornisce un miglioramento dell'SNR, consentendo l'uso di una potenza laser inferiore per proteggere la salute delle cellule e/o massimizzare la velocità di imaging. Gli obiettivi della serie CFI Apochromat TIRF di Nikon presentano anche un NA molto elevato di 1,49.

Le tecniche di microscopia a super risoluzione sono per le situazioni in cui è specificamente richiesta una risoluzione ottica oltre il limite di diffrazione per risolvere i dettagli necessari. La microscopia a super risoluzione delle cellule vive è stata generalmente una sfida a causa dei compromessi richiesti da queste varie tecniche per migliorare la risoluzione. Il sistema di illuminazione strutturata N-SIM S realizza una modulazione del pattern di illuminazione più rapida rispetto a quella utilizzata in precedenza come modulatore di luce spaziale. Yokogawa CSU-W1 SoRa è un sistema a super risoluzione implementato nel contesto di un sistema confocale a disco rotante, che consente di acquisire immagini a velocità corrispondenti al solo CSU-W1 (assumendo un segnale sufficiente).

Sebbene le tecniche di imaging a fluorescenza siano potenti, consentendo il rilevamento multiplo di bersagli molecolari distinti, le tecniche di imaging in campo chiaro come il contrasto di fase e il contrasto di interferenza differenziale (DIC) forniscono immagini cellulari dettagliate con una dose di fotoni significativamente inferiore. Sebbene tali tecniche possano mancare della specificità molecolare richiesta, è buona norma acquisire immagini in campo chiaro occasionali per aiutare a valutare la salute delle cellule nel corso dell'esperimento.