Sistema di illuminazione modulare con massima flessibilità ed espandibilità.
Il sistema Nikon Ti2-LAPP fornisce illuminatori modulari per TRIF, fotoattivazione/conversione, photobleaching, epi-fluorescenza, così come microscopia a super risoluzione (N-STORM). Ogni modulo può essere combinato in modo flessibile per costruire sistemi di microscopia ottimizzati per esigenze di ricerca individuali. Ad esempio, più moduli TIRF possono essere incorporati in un singolo microscopio per esperimenti di anisotropia e imaging TIRF veloce e multi-angolo. Combinato con lo strato di struttura del Ti2, fino a cinque moduli di illuminazione possono essere incorporati in un singolo microscopio (ad esempio due TIRF, un FRAP, un DMD e un modulo Epi-FL possono essere integrati in un Ti2).
Caratteristiche principali
Modulo H-TIRF
È ora possibile la regolazione e l'osservazione TIRF completamente automatizzate
L'angolo di incidenza ideale e la messa a fuoco per l'osservazione TIRF variano a seconda del campione e delle condizioni di osservazione. La regolazione dell'angolo di incidenza e messa a fuoco per ottenere TIRF richiede abilità ed esperienza. Il modulo H-TIRF regola automaticamente l'angolo di messa a fuoco e l’angolo d’incidenza del laser per l'osservazione TIRF monitorando il raggio di riflessione. Questa regolazione automatica della messa a fuoco laser e la regolazione dell'angolo di incidenza sono eseguite dalla funzione di allineamento automatico nel software NIS-Elements. Gli angoli di incidenza e le profondità di penetrazione dei campi evanescenti possono essere salvati e riprodotti per gli esperimenti successivi per garantire risultati di imaging costanti.
Una preparazione in vitro di proteine marcate a fluorescenza che legano microtubuli (tetrametil-rodamina e Alexa 647) e tubulina (Alexa 488) fotografata con tre diverse lunghezze d'onda usando l'illuminatore H-TIRF e il filtro di gradazione ND. Gli angoli di incidenza possono essere regolati automaticamente per diverse lunghezze d'onda.
Immagine gentilmente concessa da Melissa Hendershott e Dr. Ron Vale, University of California, San Francisco
Senza il filtro ND di gradazione, l'illuminazione TIRF mostra un profilo gaussiano nel FOV con il centro più luminoso.
Utilizzando il filtro ND di gradazione, si ottiene un'illuminazione TIRF molto uniforme.
Filtro gradazione ND in
Filtro gradazione ND out
Filtro gradazione ND in
Filtro gradazione ND out
Modulo TIRF motorizzato
L'angolo di incidenza del laser e la corrispondente profondità di penetrazione del campo evanescente possono essere controllati tramite il software NIS-Elements. Quando vengono montati più moduli TIRF (vedi immagine), la profondità di penetrazione può essere impostata indipendentemente per ciascuna lunghezza d'onda.
Modulo TIRF
Per l'osservazione della dinamica della membrana cellulare e di singole molecole
Il modulo TIRF manuale include un filtro ND a gradazione (simile al modulo H-TIRF), che consente l'illuminazione TIRF uniforme attraverso il campo visivo. Utilizzando fotocamere ad alta sensibilità, è possibile visualizzare singole molecole e dinamiche di proteine all'interno e vicino alla membrana cellulare utilizzando questo illuminatore TIRF.
Modulo N-STORM
Raggiunge una risoluzione 10 volte maggiore rispetto alla microscopia ottica convenzionale
Dotato di cambio motorizzato del campo di illuminazione (1x, 2x, 4x), oltre a una funzione di auto-allineamento, questo modulo abilita imaging in super-risoluzione N-STORM con il sistema Ti2-LAPP. Ciò fornisce un'incredibile risoluzione dell'immagine di circa 20 nm, che è 10 volte o superiore al limite della microscopia ottica convenzionale. Utilizzando la microscopia a risoluzione ottica stocastica (STORM), è possibile ottenere informazioni sulle interazioni proteina-proteina a livello molecolare.
Modulo DMD
Ottiene la fotoattivazione multipunto simultanea
Il modulo DMD consente la fotoattivazione e la fotoconversione di schemi e posizioni specificati dall'utente, mentre l'unità FRAP convenzionale consente solo la fotoattivazione di un singolo spot posizionato manualmente. La forma, la dimensione, la posizione e il numero di illuminazione DMD possono essere personalizzati utilizzando il software NIS-Elements. Questa funzionalità consente ai ricercatori di contrassegnare otticamente un sottoinsieme di cellule o popolazioni di proteine all'interno di una singola cellula o di più cellule per seguirne il comportamento. Il modulo DMD è anche ottimizzato per esperimenti di optogenetica in cui è possibile utilizzare ROI altamente personalizzato per indurre cambiamenti ottici funzionali in sottoinsiemi di cellule o popolazioni di proteine. Il modulo DMD può essere utilizzato con illuminazione laser o illuminazione LED meno fototossica.
Photoactivation
50 mins
63 mins
Un fibroblasto embrionale di topo che co-esprime laminina A marcata con mCherry A (rosso) e lamina A fotoattivabile marcata con GFP è stata fotoconvertita (verde) nella regione in basso a destra usando il modulo DMD e una luce LED da 405 nm. Le immagini time-lapse sono state catturate utilizzando l'illuminatore a epi-fluorescenza. Fotoattivando una sotto-popolazione di laminina, è possibile osservare le dinamica e il comportamento di scambio di un sottoinsieme di proteine.
Immagine per gentile concessione di Drs. Takeshi Shimi e Bob Goldman, Northwestern University Medical School
Modulo FRAP
Per l'analisi della dinamica delle proteine intracellulari
Con questo modulo FRAP, sono possibili esperimenti di photobleaching e fotoattivazione/conversione, e con fotocamere ad alta sensibilità e alta velocità di frame. Questo modulo è in grado di illuminare una posizione target nella cellula, fornendo un mezzo economico per lo studio delle dinamiche proteiche intracellulari senza l'uso di un microscopio confocale point-scanning.
Decolorazione
3 minuti
12 minuti
Un fibroblasto embrionale di topo che esprime lamina A-mCherry è stato spot-photobleached nell'angolo in alto a destra del nucleo utilizzando il modulo FRAP per studiare la dinamica delle molecole di lamina A. Le immagini time-lapse sono state acquisite usando l'illuminatore a epi-fluorescenza.
Immagine per gentile concessione di Drs. Takeshi Shimi e Bob Goldman, Northwestern University Medical School
Modulo EPI FL per FOV di grandi dimensioni
Perfetto per l'imaging a fluorescenza con fotocamere con sensori di grandi dimensioni
Il modulo EPI FL per grande FOV è un illuminatore basico a epi-fluorescenza per il sistema Ti2-LAPP, ed è progettato per applicazioni di imaging di grande FOV che utilizzano i microscopi invertiti Ti2. Offre un eccezionale campo visivo di 25 mm durante l'osservazione a epi-fluorescenza, anche se ha un design compatto. È dotato di una lente al quarzo fly-eye per garantire un'intensità uniforme su tutto il campo visivo e fornisce un'elevata trasmissione su un ampio spettro, includendo l'UV.
Combinazione di moduli flessibile
La modularità e la flessibilità della configurazione del sistema Ti2-LAPP forniscono soluzioni di imaging personalizzate per le esigenze di ricerca individuali. I moduli possono anche essere facilmente scambiati o aggiunti per adattarsi ai cambi delle esigenze sperimentali, una caratteristica importante per i laboratori con direzioni di ricerca in evoluzione e core-facilities multiutente. Ad esempio, aggiungendo un secondo modulo TIRF a una configurazione TIRF singola, gli utenti possono eseguire facilmente esperimenti di anisotropia e esperimenti TIRF rapidi e multi-angolo. L'aggiunta di un modulo di fotoattivazione/conversione come il modulo DMD o FRAP consente di tracciare delle sottopopolazioni di proteine, fornendo informazioni sui comportamenti delle proteine che altrimenti sarebbero irreali quando si effettua l’imaging dell'intera popolazione.
Capacità di configurazione a due livelli
Approfittando della struttura striata di Nikon Ti2, i moduli possono essere incorporati come due livelli separati con più moduli per livello. L'utilizzo di una configurazione a doppio strato consente una configurazione del filtro ottimale per ciascun modulo di illuminazione. Ad esempio, posizionando il modulo H-TIRF nello strato inferiore e un modulo DMD nello strato superiore, è possibile utilizzare simultaneamente cubi filtro specifici per l'imaging TIRF e la fotoattivazione nelle loro rispettive torrette di filtro, che risiedono anche negli strati inferiore e superiore. Questa configurazione consente una selezione ottimale del filtro e migliora la precisione sperimentale mantenendo le massime velocità di acquisizione.
Una cellula di Drosophila S2 che esprime EOS-tubulina. L’estremità di un singolo microtubulo è stata fotoconvertita utilizzando il modulo DMD e luce LED da 405 nm. Le immagini time-lapse in TIRF a doppio colore sono state acquisite usando l'illuminatore H-TIRF. L'aggiunta di tubulina verde non convertita all'estremità crescente del microtubulo rosso fotoconvertito e l'accorciamento (e l'eventuale scomparsa) del segmento fotoconvertito dimostrano la proprietà di instabilità dinamica dei microtubuli. Le frecce indicano l’estremità del microtubulo fotoconvertito che crescono e si accorciano
Immagine per gentile concessione di Drs. Nico Stuurman e Ron Vale, Università della California, San Francisco
Fotostimolazione e TIRF
- Ti2-LAPP
