Tecnologia di riproduzione assistita (ART)

Gli ovociti sono cellule spesse e sono solitamente coltivate in recipienti con fondo di plastica spesso, come le piastre di Petri. Ciò rende piuttosto impegnativa la selezione di una lente obiettivo appropriata, poiché gli utenti richiedono sia una distanza di lavoro più lunga che un NA elevato (per immagini ad alta risoluzione).

I recipienti di coltura non solo sono spessi, ma hanno anche un indice di rifrazione diverso dall'aria. L'obiettivo selezionato deve idealmente fornire la correzione dell'aberrazione sferica tenendo conto del recipiente. Molti obiettivi sono dotati di un anello di correzione per la correzione dell'aberrazione regolabile.

Molti degli obiettivi NAMC di Nikon, così come il nostro obiettivo 100X per IMSI, sono dotati di lunghe distanze di lavoro e di anelli di correzione, e mantengono un NA relativamente alto senza immersione.

Esistono molte tecniche di contrasto oltre alla microscopia in campo chiaro standard, ognuna con il proprio bilanciamento tra vantaggi e restrizioni. Non tutte le tecniche di contrasto sono adatte per l'uso con ICSI/IMSI.

Uno dei punti più critici è il recipiente di coltura stesso, che è generalmente realizzato in plastica anziché in vetro. Lo stato di polarizzazione della luce che viaggia attraverso la plastica non è ben mantenuto, precludendo l'uso di tecniche di polarizzazione come la microscopia a luce polarizzata e il contrasto di interferenza differenziale (DIC).

Gli obiettivi Nikon Advanced Modulation Contrast (NAMC) utilizzano l'illuminazione obliqua e un modulatore di ampiezza nell'ottica di rilevamento per polarizzare la luce diffratta rispetto alla luce di ordine zero, migliorando il contrasto rispetto alla sola illuminazione obliqua.

Il contrasto di fase è una tecnica molto diffusa, utile per campioni sottili, come l'imaging dello sperma nell’ambito dei test di motilità. Tuttavia, è limitato dall'alone artefatto durante l'imaging di campioni più spessi, come ovociti e blastocisti.

L'osservazione del fuso è una tecnica specializzata a luce polarizzata che colora otticamente il fuso meiotico negli ovociti, facendolo apparire in una tonalità ciano o rossa. È stato dimostrato che la dimensione relativa del fuso è correlata al successo della fecondazione mediante ICSI e alla successiva formazione di blastocisti e tassi di gravidanza clinica¹.

1. Tomari H, Honjo K, Kunitake K, et al. Meiotic spindle size is a strong indicator of human oocyte quality. Reprod Med Biol. 2018. 17(3): 268-274. doi:10.1002/rmb2.12100

Gli ovociti, gli spermatozoi e le blastocisti sono sensibili ai cambiamenti delle condizioni ambientali. Per questo motivo viene utilizzata una piastra riscaldante o un apparecchio simile per mantenere la temperatura appropriata, sia sul tavolino del microscopio che in qualsiasi area di conservazione del campione.