Focus sulla virologia

Filmato per gentile concessione di Rudolph Reimer, Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology

Nikon Europe BV e tutte le filiali Nikon europee stanno attentamente monitorando l’attuale situazione relativa alla diffusione del COVID-19 (coronavirus) e stanno seguendo le linee guida delle varie autorità sanitarie locali. Leggi ulteriori informazioni circa le misure messe in atto.

 

Tecnologia per l'acquisizione di immagini e la quantificazione dell'attività del virus in tempo reale

Le dimensioni estremamente piccole dei virus (5-300 nm) rendono difficile lo studio della la loro struttura e funzione. Negli ultimi secoli sono stati scoperti molti virus e sono stati persino sviluppati molti vaccini contro di loro, ma è stata l'invenzione del microscopio elettronico nel 1931 a illuminare per la prima volta la loro struttura complessa. Da quel momento, le tecniche di microscopia ottica come l'acquisizione di immagini a fluorescenza sono arrivate a svolgere un ruolo importante nella ricerca sui virus, consentendo di studiarne l'attività nei sistemi viventi. Nikon è un produttore leader di sistemi avanzati di microscopia ottica per l'acquisizione di immagini dell'attività dei virus in tempo reale ad alta risoluzione e alto rendimento. Data la crescente importanza di analisi rapide e affidabili dell'attività dei virus, Nikon è più impegnata che mai nello sviluppo e nel supporto di sistemi avanzati per questo tipo di lavoro.

Acquisizione di immagini di cellule vive

Una vasta gamma di competenze Nikon, come il campo largo ad alta velocità e la microscopia confocale, la tecnologia di software basata sull'intelligenza ariticiale (AI), e un sistema di messa a fuoco sicura in tempo reale (PFS), contribuiscono ad ottenere un imaging in time-lapse a lungo termine dei processi virali di successo e con minimo photobleaching.

Il microscopio invertito a campo largo ECLIPSE Ti2 è una potente piattaforma per l'acquisizione di immagini di cellule vive in virologia. Il suo ineguagliabile campo visivo (FOV) da 25 mm cattura in un colpo solo cambiamenti e reazioni di cellule e virus in un'ampia area di lavoro. Il Perfect Focus System (PFS) previene la deriva focale, mantenendo le cellule in movimento e i virus a fuoco costante, supportando così l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione durante le acquisizioni ad alta velocità e a lungo termine.

I microscopi confocali AX/AX R, CSU-W1 SoRa e Crest X-Light V3 hanno un FOV (fino a 25 mm) che è quasi il doppio di quello dei microscopi confocali convenzionali. Ciò consente di raccogliere più dati con una singola immagine, per una maggiore efficienza di lavoro. L'osservazione in tempo reale delle attività virali nelle cellule vive è possibile anche utilizzando la microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence), i cui moduli possono essere installati sul microscopio invertito Ti2. Il TIRF consente lo studio dei processi vicino alla membrana cellulare con un rapporto segnale-rumore eccezionalmente alto, come il meccanismo di ingresso virale nelle cellule e il suo impatto sulle interazioni cellula-cellula. La risoluzione migliorata si ottiene sul disco rotante CSU-W1 SoRa confocale utilizzando il concetto di riassegnazione ottica dei fotoni. Il disco rotante confocale Crest X-Light V3 fornisce un'illuminazione omogenea su un ampio FOV di 25 mm.

La fototossicità e il fotobleaching delle sonde fluorescenti utilizzate per marcare i virus possono essere ridotti al minimo utilizzando lo scanner risonante ad alta velocità dell'AX R. La potenza del microscopio confocale AX R risiede nella combinazione dello scanner risonante ad alta definizione e dell'ampio campo visivo di 25 mm per risultati ad alto rendimento. Tutte le soluzioni di acquisizione di immagini in cellue vive di Nikon incorporano NIS-Elements, una piattaforma software di acquisizione e analisi unificata che ora supporta i moduli basati su deep learning NIS.ai di Nikon, inclusi Clarify.ai, Denoise.ai e Enhance.ai.

Clarify.ai rimuove automaticamente la sfocatura da immagini fluorescenti a campo ampio, utilizzando una rete neurale pre-addestrata. Denoise.ai rimuove il rumore di Poisson dai dati confocali risonanti, in tempo reale o post-acquisizione, sempre utilizzando una rete neurale pre-addestrata. Se combinato con il microscopio confocale AX R, Denoise.ai consente agli utenti di acquisire rapidamente immagini con un basso rapporto segnale-rumore che normalmente, per ottenere una risoluzione sufficente, richiederebbero tempi di permanenza più lunghi per ottenere una risoluzione sufficiente. Enhance.ai è di aiuto nell'acquisizione di immagini di virus in fluorescenza in condizioni di scarsa illuminazione, condizione necessaria per i marcatori di rilevamento fotosensibili presenti in numeri bassi. La rete neurale viene addestrata utilizzando dati di immagini abbinate ad alto e basso segnale-rumore, consentendo di prevedere rapidamente versioni segnale-rumore elevate delle successive immagini di input.

Caso di studio:

Il trasporto e la diffusione del virus alfaherpes in colture neuronali è stato studiato dal team del dottor Lynn Enquist presso la Princeton University, USA, utilizzando una piattaforma di acquisizione di immagini di cellule vive Nikon ad ampio campo visivo (il microscopio invertito Eclipse Ti controllato dal software NIS-Elements). Il loro studio usa l'acquisizione di immagini di cellule vive in tempo reale e di lunghi time-lapse (durante una notte) di virus che esprimono proteine di fusione ​​fluorescenti con lo scopo di studiare gli assemblaggi virali durante l'infezione dei neuroni primari. Il loro approccio riduce anche al minimo l'impatto dell'acquisizione di immagini in fluorescenza sul virus.

(Taylor, M.P. et al. (2013) J. Vis. Exp. (78), e50723, doi:10.3791/50723).

Screening ad alto contenuto

Quando è richiesto uno screening clinico su larga scala, come i test per farmaci e virus, viene prodotta in tempi brevi una notevole quantità di dati di immagini multidimensionali. Nikon fornisce una piattaforma di screening cellulare ad alto contenuto (LIPSI), uno strumento di programmazione visiva (JOBS) e un software di analisi ad alte prestazioni (GA3) per semplificare e controllare il flusso di lavoro automatizzato consentendo una visualizzazione affidabile dell'attività del virus con un rendimento elevato.

La piattaforma di screening cellulare ad alto contenuto di Nikon, LIPSI, fornisce un'ottima soluzione per lo screening di cellule vive in più piastre completamente automatizzato. Utilizzando tutte le funzionalità del microscopio invertito Eclipse Ti2, LIPSI offre un'automazione robotica per uno screening rapido ad alto contenuto per piastre con fino 20 pozzetti!

Lo strumento General Analysis 3 (GA3) esegue le analisi di post-processamento più complesse con estrema facilità. I dati ottenuti con ogni immagine includono tutti i parametri di imaging, rendendo facile collegare i risultati delle analisi con altri parametri come le condizioni ambientali che possono essere cruciali per gli studi sui virus.

IOltre a tutte le funzioni di analisi ed elaborazione di cui dispone NIS-Elements, JOBS può creare protocolli sperimentali personalizzati. Questi possono essere eseguiti su più piastre con acquisizione e analisi completamente automatizzate. Ciò include la visualizzazione immediata dei dati di misurazione, pozzetto per pozzetto e tramite una heat map per osservare trend e eseguire ulteriori analisi. Il rendimento può essere aumentato insieme alla viabilità dei campioni utilizzando i moduli AI di NIS-Elements, come Convert.ai e Segment.ai, dove le reti neurali possono essere addestrate per classificare e segmentare le immagini. JOBS può semplificare e automatizzare l'intera piattaforma integrando funzioni come il controllo del dispositivo, l'acquisizione di immagini, l'elaborazione, l'analisi e il calcolo senza la necessità di conoscenze di programmazione avanzate.

Caso di studio:

Il gruppo di ricerca del Dr. Vibor Laketa presso l'Università di Heidelberg, in Germania, ha recentemente sviluppato un test semiquantitativo per gli anticorpi SARS-CoV-2 da utilizzare sul siero umano. Questo test da microscopio è dimostrato utilizzando un microscopio Nikon ECLIPSE Ti2 ad ampio campo visivo controllato dal modulo JOBS nel software NIS-Elements per acquisire automaticamente le immagini in piastre da 96 pozzetti. Questo nuovo test dimostra una maggiore sensibilità e specificità rispetto a un test diagnostico standard basato su ELISA, ed un rendimento elevato, necessario per programmi di screening di grandi dimensioni.

(Pape, C. et al. (2020) bioRxiv (preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.15.152587)).

Super risoluzione

Acquisizione di immagini a super risoluzione della struttura e dell'attività virale

Le particelle virali variano notevolmente in dimensioni, con un diametro compreso circa tra 5 e 300 nm, spaziando da vicino a oltre il limite di risoluzione della microscopia a fluorescenza convenzionale. Per centinaia di anni, la microscopia ottica ha potuto risolvere i dettagli cellulari solo a circa 200 nm in XY e 500 nm in Z, ma le nuove tecniche di super risoluzione hanno avuto successo nella risoluzione di dettagli biologici a circa 20 nm in XY e 50 nm in Z. Questo rende possibile studiare microrganismi piccoli e, a volte, rari (compresi i virus) con dettagli a livello quasi molecolare. Queste tecniche di super risoluzione aiutano a colmare il divario tra la microscopia a fluorescenza convenzionale e la microscopia elettronica.

Nikon offre una gamma di sistemi a super risoluzione per diverse applicazioni di acquisizione di immagini. La microscopia a illuminazione strutturata (SIM) fornisce il doppio della risoluzione di un tipico microscopio a campo largo in X, Y e Z mantenendo una velocità di acquisizione elevata e requisiti flessibili di preparazione del campione. STochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) fornisce il massimo livello di dettaglio - fino a una risoluzione 10 volte maggiore rispetto alle tecniche convenzionali.

SIM utilizza il concetto di mixaggio delle frequenze per identificare le informazioni sulla frequenza di super risoluzione nell'immagine. Questo funziona illuminando il campione con vari modelli di frequenza spaziale nota e confrontando il modo in cui l'immagine viene modulata da ciascun modello, con la successiva analisi che scopre informazioni di frequenza di super risoluzione non direttamente osservabili e le utilizza per calcolare l'immagine finale. La velocità di acquisizione per N-SIM S è fino a 15 fotogrammi al secondo, abilitata utilizzando uno Spatial Light Modulator (SLM) per la modulazione del pattern e particolarmente utile per visualizzare la rapida progressione dell'attività virale in cellule vive. L'N-SIM S può essere implementato sullo stesso supporto del microscopio come sistema confocale. Un tale approccio correlativo consente l'acquisizione rapida di immagini confocali di ampi campi visivi, riservando l'acquisizione a super risoluzione per le regioni di interesse.

Il microscopio a super risoluzione N-STORM spinge i limiti della risoluzione ottica solo "accendendo" un piccolo numero di fluorofori non sovrapposti in un campione. Ciò consente di identificare con alta precisione la posizione del baricentro dei singoli eventi di emissione. La ripetizione di questo processo su molti fotogrammi di cattura dell'immagine consente di ricostruire l'intera immagine con una risoluzione senza precedenti, a circa 20 nm nelle direzioni XY e 70 nm nella direzione Z. La lente a immersione in silicone 100x di Nikon (NA = 1,35) consente prestazioni 3D superiori in colture di cellule vive e campioni più spessi in quanto corregge meglio l'aberrazione sferica nei mezzi acquosi.

Come con tutti i microscopi Nikon, il software, NIS-Elements è fondamentale per l'imaging di successo, semplificando notevolmente l'acquisizione e l'analisi delle immagini in super risoluzione.

Caso di studio:

Il Nikon Center of Excellence (CoE) presso l' instituto Heinrich Pette Institute (HPI), di Amburgo, Germania, è un hub per la ricerca e l'educazione sui fondamenti e sui progressi della microscopia per lo studio dei virus patogeni umani. Uno studio condotto all'HPI ha dimostrato le capacità della tecnologia 3D STORM multicolore per l'imaging a super risoluzione dell'infezione da virus dell'epatite C (HCV). STORM ha consentito la visualizzazione della distribuzione spaziale del nucleo strutturale e della proteina dell'involucro E2 dell'HCV in piccole goccioline lipidiche sulla membrana del reticolo endoplasmatico nelle cellule infette. Queste aree di co-localizzazione hanno un diametro di circa 100 nm e si ritiene rappresentino siti di assemblaggio virale.

(Eggert, D. et al. (2014) PloS ONE 9(7): e102511. Doi:10.1371/journal.pone.0102511).