Imagerie de l'organisme entier et des tissus

Le développement renouvelé des méthodes de compensation optique pour augmenter la transparence des tissus biologiques a permis une meilleure observation d'échantillons plus grands et plus complexes. Dans le même ordre d'idées, les méthodes de préparation d'échantillons par microscopie d'expansion à super-résolution augmentent physiquement la taille de l'échantillon, généralement d'un facteur d'environ 4 à 10 fois ou plus, et exigent donc également des instruments adaptés à l'imagerie profonde.

Lors de l'observation d'échantillons épais au microscope, il est primordial de minimiser la différence entre l'indice de réfraction de l'échantillon et celui du milieu d'immersion afin d'atténuer au mieux l'aberration sphérique, qui limite la qualité de l'image et la distance de travail utilisable. Nikon propose des objectifs pour l'imagerie d'échantillons transparents qui peuvent être directement immergés dans une variété de milieux de transparence et comprennent des colliers de correction pour l'indice de réfraction (IR). Ces objectifs présentent également de longues distances de travail, des ouvertures numériques élevées, etc.

Nikon produit également sa série d'objectifs Silicone Immersion, CFI75 Water Dipping Series et Lambda S Objective Series (la dernière catégorie comprend plusieurs objectifs à immersion dans l'eau). Les lentilles utilisant du silicone, de l'eau et de la glycérine sont généralement plus faciles à associer aux supports de nettoyage et de montage courants, qui ont généralement un RI inférieur à l'huile mais supérieur à l'air.

Il existe des stratégies au-delà du simple filtrage spatial de la lumière, comme avec un microscope confocal, pour améliorer la capacité d'imagerie plus profonde. Une approche, qui peut être mise en œuvre sur n'importe quel microscope à fluorescence, consiste à utiliser des sondes avec des spectres d'excitation et d'émission plus décalés vers le rouge. La lumière de longueur d'onde plus longue est moins diffusée et convient donc à l'imagerie profonde. L'imagerie du spectre rouge lointain et proche infrarouge (NIR) est possible sur les séries d'instruments confocaux AX / AX R et CSU-W1.

Les avantages de l'utilisation d'un éclairage à longueur d'onde plus longue sont aggravés lorsqu'ils sont combinés à une excitation multiphotonique - le processus par lequel un fluorophore qui est généralement excité par un photon d'une énergie/longueur d'onde donnée peut à la place être excité par deux photons ou plus à longueur d'onde plus longue avec une énergie totale similaire. Ce processus est presque inexistant dans la nature car la probabilité que plusieurs photons de l'énergie correcte soient absorbés par un fluorophore à peu près au même instant est extrêmement faible.

En pratique, la réalisation d'une excitation multiphotonique nécessite un laser pulsé à la femtoseconde de très haute puissance, et même encore la densité de puissance est seulement assez élevée pour exciter la fluorescence au foyer du faisceau. Cela élimine essentiellement l'excitation de fluorescence hors foyer et évite plus ou moins le besoin d'une ouverture en sténopé pour filtrer l'émission hors foyer. Bien qu'une ouverture en sténopé puisse toujours être utilisée pour aider à améliorer la section optique, il est généralement préférable de maximiser le signal détecté, car la diffusion et d'autres problèmes subsistent.