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Super-Resolution-Mikroskopsystem

Das Prinzip der Stochastischen Optischen Rekonstruktions-Mikroskopie

Stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) rekonstruiert ein hochauflösendes Bild aus der hochgenauen Lokalisierungsinformation einzelner Fluorophore in drei Dimensionen und mehreren Farben.

N-STORM verwendet die stochastische Aktivierung einer relativ kleinen Anzahl von den vielen Fluorophoren im jeweiligen Gesichtsfeld der Probe mit einer kurzen, relativ geringen Lichtdosis. Nur diese zufällig verteilten ("aktivierten") Fluorochrome werden danach mit relativ hoher Energie zur Fluoreszenz angeregt und ihre Emissionssignale detektiert. In einem nächsten Zyklus werden wieder andere, wenige Fluorochrome aktiviert, angeregt und detektiert. Diese Zyklen werden sehr schnell und je nach Bedarf häufig wiederholt. Die zufällige, stochastische "Aktivierung" der Fluorochrome ermöglicht die zeitliche Trennung der Aufnahme der Fluoreszenzsignale, wodurch für jedes Fluorophorbild - egal, wie dicht oder weniger dicht sie beieinander liegen - ein hochgenaues Gauß-Fitting mit definiertem Maximum in XY berechenbar ist. Nur aus diesen Maximum-Punkten ("Lokalisationen") wird dann ein Bild rekonstruiert. Durch den Einsatz spezieller 3D-STORM-Optiken kann N-STORM auch einzelne Moleküle entlang der Z-Achse mit hoher Präzision lokalisieren. Die rechnerische Kombination der Lokalisationskoordinaten in den drei Dimensionen führt zu 3D-Bildern mit Super-Resolution.


Hochpräzise Erkennung der Position entlang der Z-Achse

Eine zylindrische Linse im Abbildungsstrahlengang deformiert durch Astigmatismus die Form der Punktabbildung der Fluorochromsignale asymmetrisch, wodurch ihre Z-Positionen mit einer Genauigkeit von 50 nm bestimmt werden können. Der Ort in Z wird identifiziert, indem die Orientierung der durch die spezielle Linse induzierten, jeweiligen axialen oder horizontalen Streckung (oder leichte "Verzerrung") der Signalpunktabbildung und ihre Größe ober- und unterhalb der Fokusebene erfasst wird.


Viele photoschaltbare Fluorochrome und Markierungskonzepte für eine hohe Lokalisierungsgenauigkeit

Unterschiedliche Arten von Paaren aus Aktivator- und Reporter- Fluorochromen sowie Aktivator-freie Fluoreszenz-Konjugate stehen zur Verfügung. Die Strategie mit den Aktivator-Reporter Farbstoff-Paaren erzielt bei Mehrfachmarkierungen optisch konsistente, akkurate Lokalisierungen für die jeweiligen Farb-Kanäle, indem die gleichen Reporterfarbstoffe für die verschiedenen Markierungskanäle eingesetzt werden. Die Fluorochrom-Paare bestehen jeweils aus einem Aktivator- und einem Reporter-Farbstoff, wobei über den Aktivatorfarbstoff der jeweilige Aktivierungszustand der entsprechenden Reporterfarbstoffe in den N-STORM Aufnahmezyklen reguliert wird. Mit anderen Worten: Die Wellenlänge für die jeweiligen Aktivator-Fluorochrome machen die markierungsspezifische Unterscheidung, während die Wellenlängen (Anregung/Emission) der entsprechenden Reporter-Fluorochrome, über die die eigentliche Abbildung für die optische Konsistenz sorgt.

Aktivator-freie Fluorochrome geben direkt die bildgebenden Signale für die Lokalisierungen und ermöglichen so Standard-Färbe- und Präparationstechniken, wie beispielsweise die konventionelle indirekte Immunfluoreszenzmarkierung mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern.