N-STORM

Stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) rekonstruiert ein hochaufgelöstes Bild aus der hochgenauen Lokalisierungsinformation einzelner Fluorophore in drei Dimensionen und mehreren Farben.

N-STORM verwendet die stochastische Aktivierung einer jeweils relativ kleinen Anzahl von den vielen Fluorophoren im jeweiligen Gesichtsfeld der Probe mit einer kurzen, ziemlich geringen Lichtdosis. Nur diese zufällig verteilten ("aktivierten") Fluorochrome werden danach mit relativ hoher Energie zur Fluoreszenz angeregt und ihre Emissionssignale detektiert. In einem nächsten Zyklus werden wieder andere, wenige Fluorochrome aktiviert, angeregt und detektiert. Diese Zyklen werden sehr schnell und je nach Bedarf häufig wiederholt. Die zufällige, stochastische "Aktivierung" der Fluorochrome ermöglicht die zeitliche Trennung der Aufnahme der Fluoreszenzsignale, denn für jedes Abbild eines Fluorochroms - egal, wie dicht oder weniger dicht es neben dem Abbild eines anderen liegt - wird ein hochgenaues Gauß-Fitting mit definiertem Maximum in XY berechenet. Nur aus diesen Maximum-Punkten ("Lokalisationen") wird dann ein Bild rekonstruiert. Durch den Einsatz spezieller 3D-STORM-Optiken kann N-STORM auch einzelne Moleküle entlang der Z-Achse mit hoher Präzision lokalisieren. Die rechnerische Kombination der Lokalisationskoordinaten in den drei Dimensionen führt zu 3D-Bildern mit Super-Resolution.

Hochpräzise Erkennung der Position entlang der Z-Achse

Eine zylindrische Linse im Abbildungsstrahlengang deformiert durch gezielten Astigmatismus die normalerweise runde Punktabbildung der Fluorochromsignale asymmetrisch, wodurch ihre Z-Positionen mit einer Genauigkeit von 50 nm zugeordnet werden können. Der Ort in Z wird identifiziert, indem die Orientierung der durch die spezielle Linse induzierten, jeweiligen axialen oder horizontalen ellipsoiden Verformung der Signalpunktabbildung sowie ihre jeweilige Ausprägung ober- und unterhalb der Fokusebene erfasst wird.

Viele photoschaltbare Fluorochrome und Markierungskonzepte für eine hohe Lokalisierungsgenauigkeit

Unterschiedliche Arten von Paaren aus Aktivator- und Reporter- Fluorochromen sowie Aktivator-freie Fluoreszenz-Konjugate stehen für STORM-Experimente zur Verfügung. Die Strategie mit den Aktivator-Reporter Farbstoff-Paaren erzielt bei Mehrfachmarkierungen optisch konsistente, akkurate Lokalisierungen für die jeweiligen Farb-Kanäle, indem dieselben Reporterfarbstoffe für die verschiedenen Markierungskanäle eingesetzt werden. Die Fluorochrom-Paare bestehen jeweils aus einem Aktivator- und einem Reporter-Farbstoff, wobei über den Aktivatorfarbstoff der jeweilige Aktivierungszustand der entsprechenden Reporterfarbstoffe in den N-STORM Aufnahmezyklen reguliert wird. Mit anderen Worten: Die Wellenlänge für die jeweiligen Aktivator-Fluorochrome machen die markierungsspezifische Unterscheidung, während die Wellenlängen (Anregung/Emission) für die entsprechenden Reporter-Fluorochrome, über die die eigentlichen, jeweiligen Lokalisationen erfolgen dieselben sind und so für die optische Konsistenz der Signale sorgen.

Aktivator-freie Fluorochrome geben direkt die bildgebenden Signale für die Lokalisierungen und ermöglichen so Standard-Färbe- und Präparationstechniken, wie beispielsweise die konventionelle indirekte Immunfluoreszenzmarkierung mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern.