La Microscopia a Ricostruzione Ottica Stocastica (STORM) ricostruisce un'immagine a super-risoluzione combinando le informazioni di localizzazione ad alta precisione dei singoli fluorofori in tre dimensioni e colori multipli

N-STORM utilizza l'attivazione stocastica di numeri relativamente piccoli di fluorofori utilizzando luce a intensità molto bassa. Questa "attivazione" stocastica casuale di fluorofori consente la separazione temporale di singole molecole, consentendo l'inserzione Gaussiana di alta precisione di ciascuna immagine di fluoroforo in XY. Utilizzando le ottiche speciali 3D-STORM, N-STORM può anche localizzare singole molecole lungo l'asse Z con alta precisione. Combinando computazionalmente le coordinate molecolari in tre dimensioni si ottengono immagini 3D a super-risoluzione.

Rilevamento della posizione dell'asse Z ad alta precisione

Usando una lente cilindrica che condensa in modo asimmetrico i fasci di luce in direzione X o Y, le posizioni delle molecole dell'asse Z possono essere determinate con una precisione di circa 50 nm. La posizione in Z è determinata rilevando l'orientamento dello stiramento indotto dall'astigmatismo nella direzione X o Y e la dimensione delle immagini del punto fuori fuoco. Le immagini a fluorescenza 3D possono essere ricostruite combinando le informazioni sulla posizione dell'asse determinata Z con le informazioni sulla posizione dell'asse XY.

Varietà di sonde foto-attivabili e approcci di marcatura per un'elevata precisione di localizzazione

Sono disponibili vari tipi di coppie attivatori-reporter e marcatori senza attivatore. L'approccio del colorante di coppia attivatore-reporter fornisce una precisione di localizzazione costante tra i canali facendo leva sullo stesso colorante reporter per canali diversi. Ogni coppia di coloranti è costituita da un colorante attivatore e colorante reporter, con il colorante attivatore che regola lo stato di attivazione del colorante reporter.

I marcatori senza attivatore sono costituiti solamente da colorante per imaging, consentendo la marcatura semplice e e tecniche di preparazione del campione come l'immunofluorescenza indiretta convenzionale mediante l'uso di anticorpi coniugati convenzionali.