Imagerie de cellules vivantes

L'art et la science de l'imagerie des cellules vivantes

L'imagerie des cellules vivantes oblige les utilisateurs à équilibrer soigneusement les conditions d'imagerie - l'objectif est de collecter les données essentielles minimales, ce qui minimise la perturbation du système modèle. Bien qu'il puisse être tentant d'utiliser plus de puissance d'éclairage, des expositions de caméra plus longues, etc. pour obtenir des images à rapport signal- bruit (SNR) plus élevé, il est important de comprendre que la phototoxicité peut compromettre l'intégrité physiologique et la viabilité continue du système. De plus, le photoblanchiment impose une limite pratique au nombre de photons pouvant être extraits de chaque fluorophore au cours de l'expérience.

Un autre facteur à considérer est le choix de l'objectif. Les objectifs à huile à ouverture numérique élevée (NA) peuvent bien fonctionner pour les caractéristiques d'imagerie près de la lamelle dans les cellules plates, mais souffrent d'aberration sphérique plus les images sont profondes dans l'échantillon. Cela est dû à l'indice de réfraction inférieur (RI) de la cellule/milieu de culture par rapport au verre/huile. Pour les applications d'imagerie plus profondes et 3D, il est recommandé d'utiliser des objectifs qui utilisent des supports d'immersion correspondant plus étroitement à l'IR de l'environnement d'imagerie, comme l'eau ou le silicone.

La série d'objectifs CFI Apochromat Lambda Scomprend un certain nombre d'objectifs à immersion dans l'eau, y compris le CFI Plan Apochromat IR 60XC WI, qui a le NA le plus élevé pour un objectif à immersion dans l'eau à NA = 1,27 que nous connaissons. Nikon a récemment présenté ses objectifs de la série Silicone Immersion. Le silicone a un RI d'environ 1,4, correspondant plus étroitement à l'environnement cellulaire tout en permettant des NA plus élevées que l'immersion dans l'eau. Ces objectifs sont adaptés à l'imagerie des systèmes de culture 3D tels que les organoïdes.

Minimiser la phototoxicité et le photoblanchiment dans les cellules vivantes

L'irradiation intense requise par les techniques d'imagerie basées sur la fluorescence est intrinsèquement nocive pour la santé des cellules, en particulier avec des longueurs d'onde à énergie plus élevée (décalées vers le bleu). Pour cette raison, l'utilisation de fluorophores du rouge au proche infrarouge est recommandée, bien que l'utilisation continue de fluorophores verts populaires tels que l'EGFP ne soit pas trop prohibitive et continue de bien fonctionner pour de nombreuses applications d'imagerie multicolores.

La plupart des microscopes utilisent le déclenchement logiciel des dispositifs du système. Cependant, cela peut être quelque peu lent en raison de l'imprécision relative de l'horloge de l'ordinateur et des vérifications et rappels requis des états des périphériques. À l'inverse, le déclenchement matériel utilise l'horloge de pixel de la caméra de haute précision pour coordonner les appareils tout en contournant les rappels d'appareils, maximisant ainsi la vitesse du système tout en minimisant la dose de photons. Les dispositifs déclenchés peuvent inclure des plateformes piézoélectriques Z, des illuminateurs laser/DEL et même des dispositifs personnalisés dotés d'une capacité de communication E/S.

Le déclenchement permet également des motifs d'éclairage plus complexes. Par exemple, il est possible d'utiliser le logiciel Nikon NIS-Elements pour éclairer l'échantillon uniquement lorsque tous les pixels d'une caméra sCMOS sont exposés (en tenant compte de l'effet de l'obturateur roulant) - diminution de la dose de photons et du photoblanchiment par rapport à l'éclairage continu et libre- acquisition d'images en cours. Il est également possible d'impulsions d'éclairage sur l'échelle de temps de la microseconde pendant l'exposition avec divers illuminateurs DEL et laser. L'éclairage pulsé sur cette échelle de temps permet aux fluorophores excités à un état triplet de plus de temps pour se détendre à l'état fondamental, et ainsi aider à éviter les principales voies de photoblanchiment.

Utilisation de l'intelligence artificielle basée sur le Deep Learning pour améliorer l'imagerie des cellules vivantes

L'avènement des méthodes d'intelligence artificielle (IA) pour la microscopie a ouvert de nouvelles possibilités pour l'imagerie des cellules vivantes avec une dose réduite de photons. Les méthodes basées sur le Deep Learning s'avèrent adaptées aux dosages basés sur des images de spécimens biologiques. Nikon s'engage à développer des solutions logicielles stables basées sur le Deep Learning pour diverses applications - disponibles sous forme de modules NIS.ai pour notre logiciel NIS-Elements.

Clarify.ai permet de supprimer automatiquement le flou de mise au point des images de fluorescence à champ large standard. Ce module est préformé dans notre usine et ne nécessite pas d'ajustement manuel de l'image finale basé sur l'utilisateur, supprimant ainsi la possibilité de subjectivité. Clarify.ai permet ainsi d'effectuer une coupe optique sur des images à champ large à un seul plan acquises à la vitesse maximale du système, ne nécessitant pas de données provenant de plusieurs plans comme avec la déconvolution itérative 3D des données à champ large.

Denoise.ai est un autre module préformé et utilisé pour supprimer le bruit de Poisson (bruit de tir) des images confocales en temps réel. Cela permet des temps d'exposition réduits et est avantageux lorsqu'il est utilisé en conjonction avec des images à balayage résonant acquises à l'aide du microscope confocal AX R, où le bruit de tir est la source prédominante de bruit.

Nikon propose également le module Convert.ai pour prédire les caractéristiques d'image qui sont généralement détectées dans un canal de fluorescence, avec le signal prédit basé sur une image sur fond clair correspondante (par exemple, prédiction des motifs de coloration nucléaire DAPI à partir des données d'image DIC). Cela permet d'éliminer les canaux d'imagerie par fluorescence, en évitant l'éclairage intense exigé par les techniques de fluorescence. Les techniques d'imagerie sur fond clair sont intrinsèquement moins phototoxiques.

Enhance.ai peut être formé pour prédire les détails dans les images à faible rapport signal sur bruit (SNR), améliorant efficacement le SNR et permettant une imagerie avec une dose de photons réduite et un photoblanchiment.

Quelle technique de contraste convient à votre recherche ?

Pour les échantillons bidimensionnels relativement plats, tels que les cellules adhérentes cultivées in vitro, l'imagerie par fluorescence à champ large peut être suffisante. Les cas d'utilisation et les types d'échantillons compatibles sont beaucoup plus larges lorsqu'on combine l'imagerie à grand champ avec l'analyse de déconvolution ou le brouillage automatique à l'aide du module logiciel Clarify.ai.

L'imagerie confocale devient nécessaire lors de l'imagerie d'échantillons de plus de 20 μm d'épaisseur, mais est également utile pour l'imagerie à haute résolution d'échantillons même de quelques μm d'épaisseur. Les instruments confocaux à disque rotatif sont rapides et adaptés aux échantillons jusqu'à ~ 50 μm (le CSU-W1 étant capable d'imager plus profondément que les autres modèles en raison d'un plus grand espacement entre les sténopés). Les deux systèmes sont applicables à l'imagerie de différents types de systèmes de culture cellulaire 3D, tels que les organoïdes et les sphéroïdes.

L'imagerie confocale à balayage laser est capable d'imager plus profondément, jusqu'à plusieurs centaines de μm. Le scanner résonnant présenté sur le confocal AX R est capable de fournir une imagerie à fréquence vidéo et est destiné à être combiné avec Denoise.ai pour la suppression du bruit de tir en temps réel. Contrairement aux systèmes à disque rotatif, l'AX R dispose d'un sténopé réglable en continu pour optimiser la section optique et la résolution avec n'importe quel objectif compatible.

L'imagerie par fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) est une technique de sectionnement optique qui permet l'observation exclusive des caractéristiques cellulaires se produisant à quelques centaines de nm de l'interface cellule-lamelle. Cela fournit une amélioration du SNR, permettant l'utilisation d'une puissance laser inférieure pour protéger la santé des cellules et/ou maximiser la vitesse d'imagerie. Les objectifs de la série CFI Apochromat TIRF de Nikon présentent également une NA très élevée de 1,49.e

Les techniques de microscopie à super-résolution sont utilisées lorsqu'une résolution optique au-delà de la limite de diffraction est spécifiquement requise pour résoudre les détails nécessaires. La microscopie à super-résolution de cellules vivantes a généralement été difficile en raison des compromis exigés de ces techniques variées pour améliorer la résolution. Le système d'éclairage structuré N-SIM S réalise une modulation de motif d'éclairage plus rapide qu'auparavant en utilisant lemodulateur de lumière spatiale. Le Yokogawa CSU-W1 SoRa est un système de super-résolution mis en œuvre dans le contexte d'un système confocal à disque rotatif, permettant une imagerie à des vitesses correspondant au CSU-W1 seul (en supposant un signal suffisant).

Alors que les techniques d'imagerie en fluorescence sont puissantes, permettant la détection multiplexée de cibles moléculaires distinctes, les techniques d'imagerie sur fond clair telles que le contraste de phase et le contraste d’interférencedifférentielle (DIC) fournissent des images cellulaires détaillées avec une dose de photons nettement inférieure. Bien que ces techniques puissent manquer de la spécificité moléculaire requise, il est recommandé d'acquérir occasionnellement des images sur fond clair afin d'aider à évaluer la santé des cellules au cours de l'expérience.