Mikroskopieren von Organoid- und Organ-on-a-Chip-Präparaten

Seit vielen Jahren dienen in vitro kultivierte Zellen als Modellsysteme bei unzähligen Forschungsanwendungen. Kultivierte Zellen werden in Suspension gehalten oder haften an einer Gefäßoberfläche. Die Physiologie isolierter Zellen unterscheidet sich jedoch in ziemlichem Ausmaß von der ganzer Gewebe, Organen oder Organismen. Aus diesem Grund gewinnen verschiedene dreidimensionale Systeme aus kultivierten Zellen relativ rasant an Attraktivität, darunter Organoide, „Organs-on-a-Chip“-Kammern, Sphäroide und mehr. Organe auf einem Chip sind besonders vielversprechende Modelle für das Wirkstoff-Screening, da sie Schlüsselfunktionen des interessierenden Organs/Gewebes in einem gut standardisierbaren System repräsentieren können. „Organe auf einem Chip“ oder Organoide im Allgemeinen ermöglichen oft auch die Verwendung mehrerer Zelltypen in ihrer wechselseitigen Organisation.

Mikroskop-Systeme für das Imaging von Organoiden und „Organ-on-a-Chip“-Präparaten

3D-Bildstapel eines Angiogenesemodells, das mit dem OrganoPlate®-System (MIMETAS) kultiviert wurde.

Die kürzlich vorgestellten konfokalen Mikroskope der AX / AX R-Serie von Nikon eignen sich für das 3D-Imaging von Zellkulturen. Das neue, auf künstlicher Intelligenz (KI) basierende Softwaremodul Autosignal.ai verbessert die Benutzerfreundlichkeit dieser neuen Systeme AX / AX R: die jeweils idealen Einstellungen für optimale konfokale Bilder (z. B. die Laserleistung und die Signalverstärkung) werden automatisch in Sekunden ermittelt. Beide konfokalen Systeme bieten das einzigartige große Sehfeld (FOV) von 25 mm, gekoppelt mit Scans mit einer Auflösung von 8192 x 8192 Pixel, was für die großflächige Darstellung bei voller Auflösung großer Proben wie z.B. Organoiden sehr nützlich sein kann, weil man oft auf die sequentielle Aufnahme von Ausschnittbildern (tiles) verzichten kann. Schnelles Live-Imaging ermöglicht der Hochgeschwindigkeits-Resonanzscanner des AX R, mit einer Auflösung von bis zu 2048 x 2048 Pixel über das große Seh-/Scanfeld von 25 mm.

Das konfokale Spinning Disk-System CSU-W1 von Yokogawa eignet sich auch für die Abbildung verschiedener Arten von 3D-Zellkulturen. Während Spinning-Disk-Systeme wie das CSU-W1 in der Abbildungstiefe eingeschränkter sind als Point-Scanning-Systeme, verfügt das CSU-W1 über einen extra breiten Pinhole-Abstand, um die Abbildungstiefe im Vergleich zu anderen konfokalen Spinning-Disk-Modellen zu erhöhen, indem das Pinhole-Crosstalk reduziert wird. Das CSU-W1 verfügt außerdem über ein großes Sehfeld von ~22,5 mm und eine Option für eine rotierende Scheibe mit Lochblenden mit einem Durchmesser von 25 μm. Diese ermöglicht schnelles Imaging mit Objektiven mit geringerer Vergrößerung und entsprechend größeren Scan-/Gesichtsfeldern, wobei die Konfokalität weiter und besser erhalten bleibt.

●: enthalten, ⚬: option

Verfügbare Probenhalter	AX / AX R	CSU-W1
	AX / AX R Konfokale Mikroskope	CSU-W1 Yokogawa Spinning Disk Feld Scanning konfokale Systeme
Grenzbereich für das Imaging in tieferen Schichten	~100 – 500 μm	~50 – 100 μm
Detektortyp	Multialkali- und GaAsP-basierte Einzelelement-Photodetektoren	sCMOS- und EM-CCD-Kameras
Sehfeld	25 mm	~22.5 mm
Emulate Chips	yes	yes
Emulate PODs	yes	yes
Mimetas Organoplates	yes	yes
AIM Biotech Chips	yes	yes
Nortis Chips	yes	yes
Tissuse Chips	yes	yes

Diskussion: Mikroskopie von Organoiden und “Organ-on-a-chip“-Präparaten

Dieses Bild zeigt die funktionelle Schicht in einem Emulate-Nierenchip (Epithelzellen, proximaler Tubulus). Aufnahme mit dem Nikon-Objektiv CFI S Plan Fluor LWD 20XC. Die Vorteile des Objektivs für dieses spezifische System sind der große Arbeitsabstand, der Korrekturring, das große Sehfeld und die hohe NA von 0,70. Ohne diese Objektiv-Eigenschaften ist es schwierig, Bilder mit hoher Auflösung aus dem Kammersystem des Chips heraus zu bekommen. Dieser Datensatz deckt den gesamten Bereich der Mikrofluidkanäle des Chips von unten bis oben ab, um einen vollständigen 3D-Überblick über das gesamte mikrophysiologische System zu bieten.

Die Auswahl des Objektivs für die Mikroskopie von Organoiden und Organchips

Wie bereits erwähnt, ist die größte Herausforderung bei der Mikroskopie von Organoiden und anderen 3D-Zellkulturmodellen ihre Dicke. Eine typische adhärente Zelle ist etwa 5 μm dick und kann für die Mikroskopie mit Ölimmersionsobjektiven mit hoher numerischer Apertur (NA) direkt auf einer Glasoberfläche mit optischer Qualität kultiviert werden. 3D-Kulturmodelle sind deutlich schwieriger abzubilden, da sie mehrere zehn bis hundert μm dick sein können und nicht immer direkt auf einer optisch hochwertigen Oberfläche anhaften.

Eine der wichtigsten Hardware- Wahlmöglichkeiten ist die des Objektivs. Bei Ölimmersionsobjektiven mit hoher NA fehlt es möglicherweise am erforderlichen Arbeitsabstand und/oder sie passen nicht gut zum Brechungsindex der biologischen 3D-Proben (was zu optischen Aberrationen führt). Um dieses Problem anzugehen, hat Nikon seine Reihe von Objektiven mit Silicon-Immersion eingeführt, die eine hohe NA, längere Arbeitsabstände und eine verbesserte Anpassung des Brechungsindexes durch Silikon-Immersion bieten. Nikon stellt auch Wasser-Immersionsobjektive her, die ähnliche Vorteile bieten wie Silikon-Immersionsobjektive. Weitere Einzelheiten finden Sie bei unserer Objektiv-Reihe CFI Apochromat Lambda S.

Viele Organchip- und andere Kultursysteme erfordern die Verwendung eines relativ dickwandigen Kunststoffs zwischen dem Objektiv und der Probe. In diesem Fall bieten wir Ihnen gerne die Objektiv-Reihe S Plan Fluor LWD an. Diese Reihe umfasst das Objektiv CFI S Plan Fluor 20XC, das auf eine Gefäßwanddicke von bis zu 1,8 mm korrigiert werden kann und dennoch einen großen Arbeitsabstand von 1,3 – 2,3 mm und eine für diese Objektiv-Klasse sehr hohe NA von 0,70 bietet.

Nikon Auftragsdienste für die Mikroskopie von Organoiden und Organen auf einem Chip

Die Nikon BioImaging Labs (NBILs) bieten Auftragsforschungsdienste für Biotech- und Forschungsbereiche an, einschließlich Remote-Dienste* für Kunden in weiterer Entfernung zu den jeweils aktuellen Standorten. Derzeit gibt es NBIL-Standorte in Boston, MA, USA, Leiden, Niederlande, und Shonan, Japan. Diese Labors verfügen über umfangreiche Erfahrung in der Durchführung konfokaler Mikroskopie von Organoiden und anderen 3D-Zellkultursystemen, einschließlich verschiedener kommerziell hergestellter „Organe-auf-einem-Chip“-Modelle.

Die NBILs sind nicht nur in der Lage, Daten zu erfassen, sondern ihre Full-Service-Fähigkeiten erstrecken sich auch auf das Design, die Entwicklung und die Validierung von Assays, die Zellkultur, die Probenvorbereitung und die Datenanalysen. Alle Arbeiten werden einfach pro Stunde abgerechnet, um eine Zugänglichkeit für alle Arten von Kunden zu gewährleisten. Wenn Sie mehr erfahren und sehen möchten, ob die Dienstleistungen eines NBIL das Richtige für Sie sind, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren, um eine kostenlose Beratung zu vereinbaren.

* Der Service kann je nach Einrichtung variieren. Wenden Sie sich für Einzelheiten bitte an das Nikon BioImaging Lab in Ihrer Nähe.

Glossar

Detektortyp: Konfokale Systeme mit Punktabtastung (Point-Scanner) verwenden Einzelelement-Photodetektoren (PMT‘s), das Signal wird Punkt für Punkt erfasst. Konfokale Spinning-Disk-Systeme sammeln die Signaldaten von mehreren Punkten parallel unter Verwendung eines Array-basierten Detektors (Kamera).
Grenzbereich für das Imaging in tieferen Schichten: Das ist die ungefähre Distanz entlang der Z-Achse, über die das jeweilige System mit dem Objektiv in tiefere Schichten der Probe „Hineinfokussieren“ kann, um noch optische Schnitt-Bilder mit angemessener Qualität und ausreichendem Signal-Rausch-Verhältnis zu liefern. Dieser Wert kann sehr variabel sein und hängt stark von den optischen Eigenschaften der Probe, der Art der Probenkammer sowie der (Fluoreszenz-) Färbung ab.
Sehfeld: Das Sehfeld eines Mikroskop-Systems, auch mit Sehfeldzahl bezeichnet ist Durchmesser/Diagonale (in mm) des reellen Zwischenbildes („imaging area“) bei einer nominalen Vergrößerung von 1x.
Verfügbare Probenhalter: Dies ist eine Liste von Herstellern, für deren Produkt(e) Nikon kompatible Tischadapter herstellt, um sie auf unserem motorisierten Tisch für die inversen Mikroskope Ti2 aufzunehmen.