Elettrofisiologia

Tecniche di contrasto per l'uso negli esperimenti di elettrofisiologia

Sebbene la marcatura a fluorescenza dei campioni utilizzati negli esperimenti di elettrofisiologia sia abbastanza comune, non è richiesta per la registrazione del patch-clamp. Pertanto, per visualizzare il campione viene solitamente utilizzata una tecnica di imaging senza marcatura, che può risultare difficile poiché i campioni sono spesso piuttosto spessi (ad esempio, fette di cervello che sono spesse centinaia di μm), diffondono la luce e limitano la profondità con cui è possibile eseguire un'osservazione sufficientemente dettagliata.

Sebbene le tecniche senza marcatura come la microscopia in campo chiaro e contrasto di fase possano essere utili per campioni più sottili, come colture cellulari aderenti, non sono adatte per l'imaging in sezioni di tessuto spesso o in vivo. Il contrasto di interferenza differenziale (DIC) è un'opzione grazie alla sua capacità di sezionamento ottico, che consente immagini più profonde pur mantenendo un'alta risoluzione (DIC utilizza l'intera apertura numerica dell'obiettivo).

Sfortunatamente, il DIC da solo è spesso insufficiente. Per questo motivo, Nikon offre DIC (IR-DIC) nel vicino infrarosso, che utilizza l'illuminazione nel vicino infrarosso (NIR) e componenti ottiche compatibili. La luce NIR penetra ulteriormente nei campioni in dispersione grazie alle lunghezze d'onda più lunghe della luce NIR rispetto alla luce visibile, rendendo possibile identificare i singoli neuroni a profondità in cui la luce visibile DIC non riesce.

Lenti obiettive per esperimenti di elettrofisiologia

I microscopi sono generalmente configurati con lenti dell'obiettivo a immersione in acqua per esperimenti di elettrofisiologia, in cui la punta della lente è immersa direttamente nel mezzo campione acquoso (senza vetro di copertura). Gli obiettivi di immersione in acqua per l'elettrofisiologia hanno spesso punte fatte di un materiale chimicamente inerte ed elettricamente isolante, come la ceramica. Anche il fattore di forma della lente dell'obiettivo è importante, la punta dell'obiettivo dovrebbe avere un angolo di approccio ripido verso la punta per fornire il massimo accesso al campione per i micromanipolatori.

Gli obiettivi CFI60 Water Dipping Series presentano elevati gradi di correzione dell'aberrazione e trasmittanza nel NIR, rendendoli adatti per la ricerca in elettrofisiologia, specialmente in combinazione con IR-DIC o imaging multifotonico. Tutti gli obiettivi CFI60 Water Dipping sono compatibili con IR-DIC, con gli obiettivi NIR 40X W e NIR 60X W che beneficiano inoltre della loro trasmissione NIR migliorata. Il CFI Plan 100XC W è dotato di un collare di correzione per la correzione dell'aberrazione sferica.

Gli obiettivi Nikon CFI75 Water Dipping Series includono obiettivi ad immersione d'acqua 16X e 25X e sono fisicamente più grandi degli obiettivi CFI60 di Nikon, con una dimensione di filettatura di M32 e una distanza parafocale di 75 mm per adattarsi alle grandi ottiche necessarie per raccogliere la luce a un angolo sufficientemente ampio per ottenere un'elevata apertura numerica (NA) insieme a una maggiore distanza di lavoro. Il CFI75 LWD 16X W è una scelta popolare come “soluzione a obiettivo singolo”, con ingrandimenti di 5,6X, 32X e 64X accessibili utilizzando il commutatore di ingrandimento e doppia porta FN-DP. Il CFI75 Apochromat 25XC W 1300 è uno degli obiettivi più luminosi prodotti da Nikon e presenta un'elevata trasmittanza e correzione dell'aberrazione fino a 1300 nm. Tutti gli obiettivi CFI75 Water Dipping sono anche compatibili con IR-DIC.

Configurazione del microscopio per l'elettrofisiologia e l'optogenetica

La stimolazione optogenetica delle cellule che esprimono attuatori optogenetici per varie funzioni, come il canale ionico light-gated channelrhodopsin-2 (ChR2), è un metodo popolare per una varietà di applicazioni sperimentali. La stimolazione elettrica optogenetica delle cellule neurali e muscolari è completata dalla registrazione del patch clamp come lettura. Questo metodo consente di valutare direttamente le connessioni funzionali locali ea lungo raggio di diversi neuroni. La stimolazione optogenetica viene generalmente ottenuta utilizzando l'illuminazione modellata da un dispositivo di fotostimolazione dedicato.

Il microscopio ECLIPSE FN1 può essere configurato con un dispositivo di fotostimolazione a punto singolo regolabile manualmente o da un dispositivo a microspecchio digitale (DMD). I DMD consentono l'applicazione di schemi di illuminazione arbitrari con una struttura limitata a quasi diffrazione. Ciò consente un preciso targeting da cellula a subcellulare della stimolazione con schemi programmabili dall'utente e velocità di commutazione fino a 4000 Hz.