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Super-Resolution-Mikroskopsystem

Das Prinzip der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie

Die analytische Verarbeitung der aufgenommenen Moiré-Muster, die durch Überlagerung eines bekannten hochräumlichen Frequenzmusters erzeugt werden, stellt mathematisch die Unterauflösungsstruktur einer Probe wieder her.

Die Verwendung hochräumlicher Frequenzlaserinterferenzen, um unteraufgelöste Strukturen innerhalb einer Probe zu beleuchten, erzeugt Moiré-Streifen, die aufgenommen werden. Diese Moiré-Streifen enthalten modulierte Informationen zur Unterauflösungsstruktur der Probe.

Im Rahmen der Bildverarbeitung kann die unbekannte Probeninformation wiedergewonnen werden, um eine Auflösung über die Grenze konventioneller optischer Mikroskope hinaus zu erreichen.

Die Überlagerung mit einem hochfrequenten Linienmuster ermöglicht die Extraktion der Informationen jenseits der Auflösungsgrenze aus dem sich ergebenden Moiré-Bild.


Die Herstellung von Super-Resolution Bildern durch die Verarbeitung einer Serie von Moiré-Bildern

Der Aufnahmeprozess für ein SIM-Bild - die Beleuchtung mit hoher Gitterfrequenz, Interferenz mit (unbekannten) Gitterstrukturen in der Probe, Aufnahme und mathematische Bearbeitung des sich ergebenden Moiré-Bildes und Extraktion der unbekannten Sub-Strukturen - reicht für die doppelte Verbesserung der Auflösung nicht aus. Um eine Verdopplung der Ortsauflösung im SIM-Bild zu erzielen müssen Zyclen der strukturierten Beleuchtung bei mehreren Verschiebungen (Phasen) und Orientierungen (Rotation) der Gitterstruktur durchgeführt werden, um dann aus den entsprechend der Anzahl der Gitterphasen und -ausrichtungen sich ergebenden Moiré-Bildern die erhöht ortsaufgelösten Strukturen mathematisch zu restaurieren. Das Kombinieren und Berechnen der Moiré-Bilder wird nach Fourier-Transformation im Frequenzraum vollzogen und dann in den Ortsraum zurücktransformiert. Damit wird ein SIM-Bild mit der zweifach erhöhten Auflösung geschaffen.

Erfassung mehrerer Bilder mit phasenverschobener strukturierter Beleuchtung.

Standard-Zyklus für ein SIM-Bild: drei Phasenverschiebungen mit jeweils 3 Orientierungen. Die resultierenden Datensätze aus 9 Moiré-Bildern werden mit modernen, anspruchsvollen Algorithmen verarbeitet um die hochaufgelösten Bilder zu erhalten.


Die Verwendung hochfrequenter, strukturierter Beleuchtung für doppelt erhöhte Auflösung

Die Aufnahme hochfrequenter Strukturen des Objekts wird durch die numerische Apertur (NA) des Objektivs begrenzt. Räumliche Frequenzen von Strukturdetails außerhalb des Einfallswinkels werden ausgeschlossen (Fig. A). Durch Überlagerung des hochfrequent strukturierten Lichts mit entsprechend hochfrequenten Objektstrukturen entsteht ein Moiré-Muster. Dieses hat eine niedrigere Raumfrequenz als die das Muster erzeugenden Frequenzen der Beleuchtung und der Strukturen in der Probe. Die Strukturierung des Moiré-Bildes liegt innerhalb der NA des Objektivs und kann umfänglich aufgelöst abgebildet werden. Dadurch gelangen quasi "im Moiré-Bild versteckt" die Daten der Strukturen mit doppelt erhöhter Auflösung in das Mikroskop-Objektiv mit seiner klassischen NA (Fig. B).

Wenn diese räumlichen Super-Resolution-Daten dann mathematisch aus den gespeicherten Moiré-Bildern wiederhergestellt werden, könnte man es auch so beschreiben, dass die SIM-Technik gewissermaßen die NA eines klassischen Mikroskop Objektivs verdoppelt, und so auch entsprechend seine Auflösungsgrenze (Fig. C).

Fig. A: Die Auflösung ist durch die NA des Objektivs begrenzt

Fig. B: Strukturierte Beleuchtung und normalerweise nicht auflösbare Probenstrukturen ergeben auflösbare Moiré-Bilder, die aber - mathematisch herausrechenbar - die Informationen über die Strukturen der Probe bis zur doppelt erhöhten Auflösungsgrenze enthalten.

Fig. C: Es werden Bilder mit Auflösungen erreicht, die denen von Objektiven mit etwa der doppelten NA entsprechen.