Das Prinzip der Mikroskopie mit strukturierter Beleuchtung
Kurz zusammengefasst, werden Moiré-Bilder aufgenommenen, die durch Überlagerung der hochfrequenten Streifenmuster der strukturierten Beleuchtung mit Probenstrukturen unter der Auflösungsgrenze entstehen.
Diese Moiré-Bilder werden mathematisch so ausgewertet, dass daraus Bilder geschaffen werden, in denen Probenstrukturen mit Dimensionen auch unter der klassischen Auflösungsgrenze dargestellt sind.
Das hochfrequente Gittermuster, das durch die (kohärente) Laser-Beleuchtung durch Liniengitter mit genügend hohen Gitterkonstanten durch das Objektiv in die Probe fokussiert wird, interferiert dort mit den (unbekannten) Gitterstrukturen mit Dimensionen unter der normalen Auflösungsgrenze, sodass Moiré-Bilder entstehen. Deren Strukturen wiederum liegen innerhalb des klassischen Auflösungsvermögens und können umfänglich durch das Mikroskop-Objektiv aufgenommen werden. Diese Moiré-Bilder enthalten - moduliert - auch die Informationen der (unbekannten) sub-resolution Strukturen der Probe.
Mit Bildanalyse-Software kann aus den klaren Moiré-Bildern die unbekannte Probeninformation mathematisch wiedergewonnen und bildlich dargestellt werden. In den resultierenden SIM-Bildern sind folglich auch Feinstrukturen zu erkennen, die unterhalb der Auflösungsgrenze des konventionellen Lichtmikroskops liegen.
Die Überlagerung mit einem hochfrequenten Linienmuster ermöglicht die Extraktion der Informationen jenseits der Auflösungsgrenze aus dem sich ergebenden Moiré-Bild.
Die Herstellung von Super-Resolution Bildern durch die Verarbeitung einer Serie von Moiré-Bildern
Der Aufnahmeprozess für ein SIM-Bild - die Beleuchtung mit hoher Gitterfrequenz, Interferenz mit (unbekannten) Gitterstrukturen in der Probe, Aufnahme und mathematische Bearbeitung des sich ergebenden Moiré-Bildes und Extraktion der unbekannten Sub-Strukturen - reicht für die doppelte Verbesserung der Auflösung nicht aus. Um eine Verdopplung der Ortsauflösung im SIM-Bild zu erzielen müssen Zyclen der strukturierten Beleuchtung bei mehreren Verschiebungen (Phasen) und Orientierungen (Rotation) der Gitterstruktur durchgeführt werden, um dann aus den entsprechend der Anzahl der Gitterphasen und -ausrichtungen sich ergebenden Moiré-Bildern die erhöht ortsaufgelösten Strukturen mathematisch zu restaurieren. Das Kombinieren und Berechnen der Moiré-Bilder wird nach Fourier-Transformation im Frequenzraum vollzogen und dann in den Ortsraum zurücktransformiert. Damit wird ein SIM-Bild mit der zweifach erhöhten Auflösung geschaffen.
Erfassung mehrerer Bilder mit phasenverschobener strukturierter Beleuchtung.
Standard-Zyklus für ein SIM-Bild: drei Phasenverschiebungen mit jeweils 3 Orientierungen. Die resultierenden Datensätze aus 9 Moiré-Bildern werden mit modernen, anspruchsvollen Algorithmen verarbeitet um die hochaufgelösten Bilder zu erhalten.
Die Verwendung hochfrequenter, strukturierter Beleuchtung für doppelt erhöhte Auflösung
Die Aufnahme hochfrequenter Strukturen des Objekts wird durch die numerische Apertur (NA) des Objektivs begrenzt. Räumliche Frequenzen von Strukturdetails außerhalb des Einfallswinkels werden ausgeschlossen (Fig. A). Durch Überlagerung des hochfrequent strukturierten Lichts mit entsprechend hochfrequenten Objektstrukturen entsteht ein Moiré-Muster. Dieses hat eine niedrigere Raumfrequenz als die das Muster erzeugenden Frequenzen der Beleuchtung und der Strukturen in der Probe. Die Strukturierung des Moiré-Bildes liegt innerhalb der NA des Objektivs und kann umfänglich aufgelöst abgebildet werden. Dadurch gelangen quasi "im Moiré-Bild versteckt" die Daten der Strukturen mit doppelt erhöhter Auflösung in das Mikroskop-Objektiv mit seiner klassischen NA (Fig. B).
Wenn diese räumlichen Super-Resolution-Daten dann mathematisch aus den gespeicherten Moiré-Bildern wiederhergestellt werden, könnte man es auch so beschreiben, dass die SIM-Technik gewissermaßen die NA eines klassischen Mikroskop Objektivs verdoppelt, und so auch entsprechend seine Auflösungsgrenze (Fig. C).
Fig. A: Die Auflösung ist durch die NA des Objektivs begrenzt
Fig. B: Strukturierte Beleuchtung und normalerweise nicht auflösbare Probenstrukturen ergeben auflösbare Moiré-Bilder, die aber - mathematisch herausrechenbar - die Informationen über die Strukturen der Probe bis zur doppelt erhöhten Auflösungsgrenze enthalten.
Fig. C: Es werden Bilder mit Auflösungen erreicht, die denen von Objektiven mit etwa der doppelten NA entsprechen.
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