Imaging di un intero organismo e Imaging dei tessuti

L'imaging profondo in interi organismi, organi e tessuti è una delle maggiori sfide poste al microscopista ottico. I campioni biologici sono ambienti otticamente imperfetti, che disperdono sia la luce d’illuminazione che la luce di rilevamento. La dispersione e varie aberrazioni ottiche peggiorano progressivamente con l'aumentare della distanza nel campione, imponendo quindi un limite pratico alla possibile profondità di imaging.

Prodotti per l'imaging dell'intero organismo e dei tessuti

**Pesce zebra embrionale**

20X LWD 1.0 NA WD 2.8mm
Per gentile concessione di Erika Driekorn e Dr. Beth Roman, Dipartimento di Genetica Umana, Università di Pittsburgh, Scuola di Dottorato di Salute Pubblica.

La soluzione leader di Nikon per le applicazioni di imaging profondo è il sistema di microscopio multifotonico AX R MP. Questo sistema supporta lunghezze d'onda di eccitazione fino a 1300 nm, consentendo l'imaging fino a 1,4 mm all’interno del campione. È inoltre possibile eseguire la scansione simultanea con due raggi, accelerando l'acquisizione di immagini multicolori multifotone.

Per l'imaging fino a poche centinaia di micrometri (µm) di profondità, Nikon offre il sistema di microscopio confocale AX / AX R. Il rilevamento confocale con un singolopinhole, come con AX / AX R, consente una maggiore reiezione della luce fuori fuoco e miglior sezionamento ottico, in confronto agli strumenti confocali che utilizzano una serie di pinhole.

Il sistema confocale Yokogawa CSU-W1 a disco rotante è ottimizzato per l'imaging di campioni più grandi rispetto alla maggior parte degli strumenti a disco rotante. È caratterizzato da una più ampia spaziatura tra i pinhole nel disco rotante per ridurre l’interferenza tra i pinhole, una funzione utile per le applicazioni di imaging profondo.

●: included, ⚬: option

Supporti per microscopio compatibili	AX R MP	AX / AX R	CSU-W1
	AX R MP Sistema microscopico multifotone	AX / AX R Sistema di microscopia confocale	CSU-W1 Scanner confocale a disco rotante
Campo visivo	Diagonale da 22 mm (quadrato)	Diagonale da 25 mm (quadrato)	17 x 16 mm (rettangolare)
Limite di profondità di imaging relativo	~ 1,4 mm (con eccitazione a 1300 nm)	~ 100 – 500 μm	~ 50 – 100 μm
Supporta l'imaging video-rate	Sì (30 FPS con scansione 512 x 512)	Sì (30 FPS con scansione 512 x 512; solo AX R)	Sì (limitato dal sistema della videocamera e dalla velocità di rotazione del disco)
Opzioni del rivelatore	Rivelatori GaAsP non descansionati (NDD), fino a 4 canali.	Sono disponibili rilevatori GaAsP e a tubo fotomoltiplicatore (PMT) multi-alcalino. Fino a 4 canali.	Si consigliano telecamere sCMOS o EM-CCD monocromatiche. Sono disponibili opzioni multicamera e di divisione della camera.
ECLIPSE Ti2-E Invertito	yes	yes	yes
ECLIPSE Ti2-A Invertito	no	no	yes
ECLIPSE Ti2-U Invertito	no	no	yes
ECLIPSE Ni-E Verticale	no	yes	yes
ECLIPSE Ni-U Verticale	no	no	yes
FN1 Verticale	no	yes	yes
AX-FNGP Verticale	yes	no	no
AX-FNSP Verticale	yes	no	no

Discussione sull'imaging dell'intero organismo e dei tessuti

Schiarimento dei tessuti

Circuito uditivo di tronco cerebrale di pulcino, schiarito con il protocollo CUBIC. (E17)
Colorante: Tetbow (transattivatore di tetraciclina Brainbow)
CFI Plan Apochromat 10XC Glyc
Dr. Ryo Egawa, Dr. Hiroshi Kuba, Fisiologia Cellulare, Scuola di specializzazione in Medicina, Università di Nagoya

Obiettivi per lo schiarimento dei tessuti e compatibili

Il processo di sviluppo dei metodi di schiarimento ottico per aumentare la trasparenza dei tessuti biologici ha consentito una migliore osservazione di campioni più grandi e complessi. Contemporaneamente, i metodi di preparazione del campione per microscopia a espansione a super risoluzione aumentano fisicamente le dimensioni del campione, di solito di un fattore di ~4-10X o più, e quindi anch’essi richiedono strumenti adatti per l'imaging profondo.

Quando si osservano campioni spessi al microscopio, è della massima importanza ridurre al minimo la differenza tra l'indice di rifrazione del campione e quello del mezzo di immersione per mitigare al meglio l'aberrazione sferica, che limita la qualità dell'immagine e la distanza di lavoro utilizzabile. Nikon offre obiettivi per l'imaging di campioni schiariti che possono essere immersi direttamente in una varietà di mezzi schiarenti e includono anelli di correzione per l'indice di rifrazione (RI). Questi obiettivi inoltre presentano distanze di lavoro lunghe, aperture numeriche elevate e altro ancora.

Nikon produce anche gli obiettivi delle serie Silicone Immersion, CFI75 Water Dipping e Lambda S Objective (l'ultima categoria comprende diversi obiettivi a immersione in acqua). Le lenti che utilizzano immersione in silicone, acqua e glicerina sono generalmente più facili da abbinare ai comuni mezzi di schiarimento e montaggio, che di solito hanno un RI minore dell'olio ma maggiore dell'aria.

Imaging *in vivo* di un topo YFP-H anestetizzato (età: 4 settimane) con il metodo del cranio aperto. Visualizzazione dell'intero strato V dei neuroni piramidali e dei neuroni più profondi dell’ippocampo. Imaging profondo realizzato per l'imaging tridimensionale di dendriti ippocampali fino a 1,4 mm nel cervello.
Catturato con GaAsP NDD episcopico per 1300 nm e obiettivo CFI75 Apochromat 25XC W 1300 (NA 1,10, WD 2,0 mm), Lunghezza d'onda di eccitazione: 1040 nm
Fotografato con la collaborazione di: Dott.i Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi e Tomomi Nemoto, Istituto di ricerca per l’elettronica, Università di Hokkaido

Strategie di illuminazione per imaging in maggiore profondità

Esistono strategie che vanno oltre al semplice filtraggio spaziale della luce, come in un microscopio confocale, per migliorare la capacità di imaging in maggiore profondità. Un metodo, che può essere implementato su qualsiasi microscopio a fluorescenza, consiste nell'utilizzare sonde con spettri di eccitazione ed emissione più spostati verso il rosso. La luce a lunghezza d'onda più lunga si disperde meno e risulta quindi adatta per l'imaging profondo. L'imaging dello spettro del far-red e del vicino-infrarosso (NIR) è possibile su entrambe le serie di strumenti confocali AX / AX R e CSU-W1.

I vantaggi dell'utilizzo dell'illuminazione a lunghezza d'onda più lunga sono maggiori se combinati con l'eccitazione multifotonica, il processo per cui un fluoroforo, che è solitamente eccitato da un fotone di una data energia/lunghezza d'onda, può invece essere eccitato da due o più fotoni di lunghezza d'onda più lunga con energia totale simile. Questo processo è quasi inesistente in natura poiché la probabilità che più fotoni dell'energia corretta vengano assorbiti da un fluoroforo quasi esattamente nello stesso istante è estremamente bassa.

In pratica, il raggiungimento dell’eccitazione multifotonica richiede un laser di potenza molto elevata pulsato a femtosecondi. Nonostante questo, la densità di potenza è appena sufficientemente alta da eccitare la fluorescenza nel fuoco del raggio. Ciò elimina essenzialmente l'eccitazione della fluorescenza fuori fuoco e più o meno ovvia alla necessità di un pinhole per filtrare l'emissione fuori fuoco. Sebbene un pinhole possa essere utilizzato per aiutare a migliorare il sezionamento ottico, solitamente è invece desiderabile massimizzare il segnale rilevato, poiché permangono la dispersione e altri problemi.

Glossario

Campo visivo: Il campo visivo del sistema, indicato anche come numero di campo, è il diametro dell'area di imaging con un ingrandimento nominale di 1X.
Limite di profondità di imaging relativo: Ciò indica l'intervallo di profondità Z (assiale) approssimativo entro il quale il sistema indicato può fornire immagini con qualità di sezionamento ottico e rapporto segnale-rumore sufficienti. Questo valore può essere abbastanza variabile e dipende fortemente dalle proprietà ottiche del campione e del recipiente, nonché dalla marcatura.
Opzioni del rivelatore: I sistemi multifotonici a scansione puntiforme e confocali utilizzano generalmente rivelatori a elemento singolo, come i tubi fotomoltiplicatori (PMT), mentre gli strumenti confocali a disco rotante e a campo largo utilizzano videocamere digitali.
Supporta l'imaging video-rate: La “velocità video” è tradizionalmente definita come circa 30 fotogrammi al secondo (FPS). La velocità di imaging ottimale dipende dall'applicazione esatta e può essere più veloce o più lenta di 30 FPS. Le camere EM-CCD possono acquisire generalmente immagini fino a 60 FPS (full frame) e le telecamere sCMOS fino a 40-100 FPS (full frame).
Supporti per microscopio compatibili: Questo si riferisce ai modelli di supporto per microscopio Nikon compatibili con ciascun sistema.