Tecnologia di riproduzione assistita (ART)
Le tecniche di riproduzione assistita (ART) includono procedure correlate alla fecondazione in vitro (IVF) come la fecondazione in vitro convenzionale, in cui l'uovo e lo sperma sono combinati in un piatto e la fecondazione avviene senza iniezione, l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) e l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi morfologicamente selezionati (IMSI). L'iniezione tramite ICSI/IMSI viene eseguita utilizzando micromanipolatori montati direttamente sopra il tavolino di un microscopio invertito.
Prodotti per la tecnologia di riproduzione assistita (ART)
Il microscopio invertito ECLIPSE Ti2-U IVF è adatto per applicazioni di ART, essendo caratterizzato da un telaio stabile compatibile con una gamma di micromanipolatori prodotti da terzi. Il Ti2-U IVF presenta anche un design “laser-safe” compatibile con vari sistemi basati su laser progettati per applicazioni correlate con la ART. Un ingrandimento intermedio può essere inserito nel corpo del microscopio (disponibili 1,5X e 2,0X), consentendo un imaging dettagliato con obiettivi a basso ingrandimento. Ad esempio, è possibile ottenere un ingrandimento totale di 300X utilizzando oculari standard 10X, un ingrandimento intermedio 1,5X e un obiettivo 20X. Per il Ti2-U IVF sono disponibili opzioni di illuminazione sia a LED che alogene.
●: included, ⚬: option
| ECLIPSE Ti2-U IVF Microscopio invertito |
|
|---|---|
| Compatibilità con micromanipolatori | yes |
| Integrazione della camera | yes |
| Fonte di illuminazione | LED o alogene |
| Disponibilità di controllo termico | yes |
| Tecniche di contrasto compatibili | ECLIPSE Ti2-U IVF |
| Osservazione del fuso | yes |
| Contrasto di interferenza differenziale (DIC) | yes |
| Contrasto a modulazione avanzata Nikon (NAMC) | yes |
| Illuminazione obliqua | no |
| Contrasto di fase | yes |
Discussione sulla tecnologia di riproduzione assistita (ART)
Immagini NAMC di un ovocita prima e durante l'iniezione.
Difficoltà nell'imaging di ovociti ed embrioni
Gli ovociti sono cellule spesse e sono solitamente coltivate in recipienti con fondo di plastica spesso, come le piastre di Petri. Ciò rende piuttosto impegnativa la selezione di una lente obiettivo appropriata, poiché gli utenti richiedono sia una distanza di lavoro più lunga che un NA elevato (per immagini ad alta risoluzione).
I recipienti di coltura non solo sono spessi, ma hanno anche un indice di rifrazione diverso dall'aria. L'obiettivo selezionato deve idealmente fornire la correzione dell'aberrazione sferica tenendo conto del recipiente. Molti obiettivi sono dotati di un anello di correzione per la correzione dell'aberrazione regolabile.
Molti degli obiettivi NAMC di Nikon, così come il nostro obiettivo 100X per IMSI, sono dotati di lunghe distanze di lavoro e di anelli di correzione, e mantengono un NA relativamente alto senza immersione.
Immagine a contrasto di fase di sperma in un test di motilità
Ovocita visualizzato utilizzando il sistema di osservazione del fuso di Nikon. Il fuso meiotico è visibile in ciano nella porzione in basso a sinistra della cellula.
Tecniche di contrasto per ICSI/IMSI
Esistono molte tecniche di contrasto oltre alla microscopia in campo chiaro standard, ognuna con il proprio bilanciamento tra vantaggi e restrizioni. Non tutte le tecniche di contrasto sono adatte per l'uso con ICSI/IMSI.
Uno dei punti più critici è il recipiente di coltura stesso, che è generalmente realizzato in plastica anziché in vetro. Lo stato di polarizzazione della luce che viaggia attraverso la plastica non è ben mantenuto, precludendo l'uso di tecniche di polarizzazione come la microscopia a luce polarizzata e il contrasto di interferenza differenziale (DIC).
Gli obiettivi Nikon Advanced Modulation Contrast (NAMC) utilizzano l'illuminazione obliqua e un modulatore di ampiezza nell'ottica di rilevamento per polarizzare la luce diffratta rispetto alla luce di ordine zero, migliorando il contrasto rispetto alla sola illuminazione obliqua.
Il contrasto di fase è una tecnica molto diffusa, utile per campioni sottili, come l'imaging dello sperma nell’ambito dei test di motilità. Tuttavia, è limitato dall'alone artefatto durante l'imaging di campioni più spessi, come ovociti e blastocisti.
L'osservazione del fuso è una tecnica specializzata a luce polarizzata che colora otticamente il fuso meiotico negli ovociti, facendolo apparire in una tonalità ciano o rossa. È stato dimostrato che la dimensione relativa del fuso è correlata al successo della fecondazione mediante ICSI e alla successiva formazione di blastocisti e tassi di gravidanza clinica1.
1. Tomari H, Honjo K, Kunitake K, et al. Meiotic spindle size is a strong indicator of human oocyte quality. Reprod Med Biol. 2018. 17(3): 268-274. doi:10.1002/rmb2.12100
Esempio di scalda-campioni per il mantenimento della temperatura del campione.
Controllo dell’ambiente per cellule sensibili
Gli ovociti, gli spermatozoi e le blastocisti sono sensibili ai cambiamenti delle condizioni ambientali. Per questo motivo viene utilizzata una piastra riscaldante o un apparecchio simile per mantenere la temperatura appropriata, sia sul tavolino del microscopio che in qualsiasi area di conservazione del campione.
Ulteriori informazioni su tecnologia di riproduzione assistita (ART) e microscopia
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Glossario
- Compatibilità con micromanipolatori
- La micromanipolazione è necessaria per il controllo e il posizionamento delle micropipette.
- Contrasto a modulazione avanzata Nikon (NAMC)
- NAMC e le relative tecniche di contrasto di modulazione combinano l'illuminazione obliqua con la modulazione della luce raccolta per correggere il rilevamento della luce diffratta, che migliora ulteriormente il contrasto.
- Contrasto di fase
- Il contrasto di fase è una tecnica contrastante spesso utilizzata per l'imaging di campioni sottili e relativamente trasparenti, come le colture cellulari. È compatibile con recipienti di plastica. Viene applicato ai test di motilità degli spermatozoi e applicazioni simili.
- Contrasto di interferenza differenziale (DIC)
- DIC fornisce la massima risoluzione e le massime prestazioni di sezionamento ottico tra le tecniche qui elencate, ma non è compatibile con recipienti di plastica. DIC è quindi utile per la valutazione morfologica dettagliata dello sperma per IMSI.
- Disponibilità di controllo termico
- La regolazione della temperatura è importante per la salute delle cellule. Nikon offre una varietà di regolatori termici sia per la parte superiore del palco che per l'area di attesa.
- Fonte di illuminazione
- Le sorgenti di illuminazione per le tecniche di contrasto basate sulla luce trasmessa sono spesso diodi a emissione di luce (LED) o lampade alogene. I LED sono una scelta luminosa, ecologica e più efficiente dal punto di vista energetico.
- Illuminazione obliqua
- Le tecniche di illuminazione obliqua si basano su un’illuminazione ad angolo obliquo per fornire un contrasto simile a un rilievo. Esistono molte varianti di questa tecnica e la maggior parte sono compatibili con i recipienti di plastica.
- Integrazione della camera
- Nikon offre una varietà di opzioni per la camera, comprese le opzioni CMOS a colori e monocromatiche veloci.
- Osservazione del fuso
- L'osservazione del fuso è una tecnica di microscopia a luce polarizzata che consente la visualizzazione del fuso meiotico con contrasto di colore. Non è compatibile con recipienti in plastica.