Focus su Imaging per neurobiologia

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Nikon supporta una varietà di applicazioni basate su microscopia di imaging per neurobiologia.

Il panorama dell'imaging per neurobiologia sta rapidamente cambiando per via dei progressi tecnici in settori consolidati come la chiarificazione dei tessuti e l’imaging multifotone in vivo, ma anche per l'emergere di nuove entusiasmanti tecnologie come l’optogenetica e la microscopia a super risoluzione. Nikon è impegnata nello sviluppo, nel perfezionamento e il supporto di tecnologie che consentono una ricerca di neurobiologia all'avanguardia.

Imaging profondo In Vivo e Intravital

L'imaging multifotone fornisce un sezionamento ottico superiore in campioni di grandi dimensioni.

Le microscopie multifotone sfruttano laser infrarossi ad alta potenza a impulsi di femtosecondi per eccitare la fluorescenza in profondità all'interno di campioni impegnativi. La densità di potenza richiesta per l'assorbimento di più fotoni viene realizzata solo nel focus del laser, limitando l'eccitazione a un piccolo volume focale e riducendo così al minimo la fluorescenza fuori fuoco. Combinata con la capacità della luce IR di penetrare mezzi fortemente dispersivi, l'imaging multifotone fornisce sia una maggiore profondità di penetrazione che un superiore sezionamento ottico, importante per l'imaging di tessuti spessi e disperdenti.

  • Il sistema multifotone A1R MP+ fornisce prestazioni di sezionamento ottico profondo di un sistema multifotone insieme alla capacità di imaging ad alta velocità del nostro nuovo scanner risonante ad alta definizione (HD). La scansione a risonanza consente l'imaging a velocità video (30 fotogrammi al secondo e oltre), importante per catturare dinamiche veloci come la segnalazione del calcio. Altre funzioni avanzate includono la scansione a doppio raggio per imaging simultaneo multicanale, allineamento laser automatico, rilevamento non descansionato, compatibilità a 1300 nm e altro.
  • La nostra serie di obiettivi per microscopio ad immersione in acqua CFI75 offre un'eccezionale trasmissione a infrarossi, alti NA, lunghe distanze di lavoro e ampi campi visivi . Il 25xW MP presenta una distanza di lavoro NA = 1,10 e 2,0 mm leader del settore. Il nostro obiettivo LWD 16xW può essere utilizzato per l'imaging con ingrandimenti di 5,6x, 32x e 64x insieme a un modulo di ingrandimento dedicato per il nostro microscopio verticale FN1.

Immagine in vivo di un topo YFP-H anestetizzato (età: 4 settimane) con il metodo del cranio aperto.Visualizzazione dell’intero strato V dei neuroni piramidali e dei neuroni più profondi dell’ippocampo. Imaging profondo realizzato per l’imaging tridimensionale dei dendriti dell’ippocampo fino a 1,4 mm nel cervello.

Catturato con GaAsP NDD episcopico per 1300 nm e obiettivo CFI75 Apochromat 25XC W 1300 (NA 1.10, WD 2.0 mm)

Lunghezza d'onda di eccitazione: 1040 nm

Cortesia fotografica di Dott.i Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi e Tomomi Nemoto,
Istituto di ricerca per l’elettronica,
Università di Hokkaido

① Pyramidal cells in layer V

② White matter

③ Alveus

④ Hippocampal pyramidal cells

⑤ Hippocampus 3D zoom image

Elettrofisiologia

I ricercatori necessitano di una piattaforma di microscopia stabile e accessibile per eseguire esperimenti sensibili di elettrofisiologia.

L'elettrofisiologia è lo studio delle proprietà elettriche di sistemi biologici, come i neuroni, usando microelettrodi per leggere e manipolare i segnali elettrici. L'accessibilità al campione è una priorità assoluta per gli elettrofisiologi poiché il posizionamento degli elettrodi richiede precisione a livello di micron. Il microscopio deve essere eccezionalmente stabile e non interferire con altri apparecchi di misurazione. Il microscopio dritto Nikon FN1 ha un profilo sottile e accessibile a forma di I per la massima accessibilità del campione e personalizzazione del sistema, perfetto per esperimenti di patch clamp. Il nostro portaobiettivi scorrevole per FN1 rende facile la retrazione e il cambio di obiettivi evitando collisioni con strumenti sensibili. La nostra serie di obiettivi CFI60 Water Dripping offre angoli di approccio del manipolatore ripidi, alta NA, lunghe distanze di lavoro e punte in ceramica inerti.

Optogenetica

L'illuminazione a pattern permette potenti applicazioni di optogenetica.

L’optogenetica è una famiglia di tecniche sperimentali che forniscono un controllo dei processi biologici attraverso la luce, tra cui la stimolazione di singoli neuroni che esprimono rodopsine di canale esogene. Inoltre, i reporter ottici come il calcio fluorescente e i sensori di voltaggio possono essere utilizzati per leggere l'attività in un esperimento progettato interamente per ottiche. Tuttavia il controllo della distribuzione spaziotemporale della stimolazione deve essere preciso ed indipendente dall'illuminazione di lettura. La stimolazione optogenetica a pattern si ottiene con massima robustezza utilizzando un Digital Micromirror Device (DMD), una serie di centinaia di migliaia di specchi in micro-scala controllabili indipendentemente. Nikon offre molteplici soluzioni DMD e dispositivi di stimolazione point-scanning per la ricerca optogenetica * .

Leggi la nostra nota di applicazione sull’optogenetica per informazioni sull'utilizzo di DMD per controllare la segnalazione in embrioni in sviluppo.

* I prodotti disponibili possono variare a seconda dell'area del mondo.

Imaging di tessuti chiarificati

Obiettivi progettati per l'imaging di campioni chiarificati e con indice di rifrazione abbinati.

Le tecniche di chiarificazione e abbinamento di indice di rifrazione (RI) come CLARITY hanno cambiato radicalmente il modo in cui ci avviciniamo all'immagine dei tessuti. In precedenza, i ricercatori avrebbero tagliato meccanicamente tessuti di grandi dimensioni e in seguito eseguito imaging sulle singole sezioni. Questo approccio sfortunatamente richiede molto tempo e rompe il contesto 3D del campione, nascondendo relazioni fondamentali. La chiarificazione dei tessuti consente di caratterizzare rapidamente la struttura tridimensionale continua di campioni interi, fornendo più informazioni di prima. Tuttavia, l'imaging ottimale dei tessuti chiarificati richiede ottiche specializzate caratterizzate da un basso ingrandimento, un'elevata apertura numerica e la capacità di regolare le correzioni ottiche nell'obiettivo per diversi indici di rifrazione corrispondenti a diversi metodi di chiarificazione. Nikon ha recentemente introdotto due nuovi obiettivi per microscopio per rispondere a queste esigenze:

  • Il nostro obiettivo di immersione in glicerina CFI60 10xC Glyc può correggere gli indici di rifrazione fra 1,33 - 1,51, corrispondenti al RI dei più comuni reagenti di compensazione, e presenta un NA = 0,5.
  • L'obiettivo di immersione in glicerina CFI90 20xC Glyc di Nikon è caratterizzato da una distanza parafocale unica di 90 mm, che consente sia un NA incredibilmente alto di 1,0 che un ampio campo visivo, il tutto mantenendo un’ultra-lunga distanza operativa di 8,2 mm. Questa combinazione di funzionalità si traduce in un obiettivo ideale per l'imaging di tessuti di grandi dimensioni in combinazione con i strumenti di scansione/stitching di grandi immagini disponibili nel software NIS-Elements.

Imaging ultrastrutturale con Super-risoluzione

La Super-risoluzione di STORM illumina dettagli neuronali mai visti prima con risoluzione in nanoscala e alta specificità.

A differenza di microscopie standard limitate da diffrazione, le tecniche di super risoluzione forniscono una risoluzione a livello sub-organellare. I dettagli cellulari ultrastrutturali precedentemente osservati solo mediante microscopia elettronica (EM) sono stati risolti mediante super-risoluzione e con la specificità molecolare superiore e la capacità di multiplexing dell'imaging a fluorescenza. La microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM) utilizza il concetto di localizzazione di singole molecole per individuare singoli eventi di emissione di fluorescenza con precisione di un singolo nanometro. Questa tecnica è stata utilizzata per scoprire sia la struttura periodica del citoscheletro degli assoni (non osservabile da EM) che l'architettura dell'impalcatura del segmento iniziale degli assoni. Diversi gruppi di ricerca hanno applicato STORM per quantificare la distribuzione delle proteine ​​sinaptiche. Nikon rende la tecnica STORM accessibile ai neuroscienziati tramite il nostro sistema N-STORM 5.0 . Inoltre, con il nostro sistema di illuminazione strutturato N-SIM S è ora possibile eseguire rapidamente immagini a super-risoluzione fino a 15 fotogrammi al secondo.

Christophe Leterrier Ph.D., NeuroCyto, Marseille, France

Stitching di grandi immagini

Potenti strumenti di acquisizione e analisi immagine avanzata

Il software NIS-Elements offre un controllo completo dell'acquisizione, dell'analisi e della visualizzazione dei dati. Le applicazioni di neurobiologia richiedono spesso di lavorare con campioni di grandi dimensioni. NIS-Elements semplifica l'esecuzione di scansione/stitching di immagini di grandi dimensioni e z-stacking, rendendo più semplice l'acquisizione di grandi dataset 3D (e 4D). Potenti strumenti di visualizzazione forniscono immagini straordinarie per la condivisione e la presentazione dei dati. Gli strumenti di programmazione grafica come JOB semplificano i flussi di lavoro di acquisizione e analisi personalizzati, compresi i flussi di lavoro condizionali avanzati (ad es. acquisizioni automatizzate che dipendono dai risultati dell'analisi). Le lunghe fasi di analisi come la segmentazione delle immagini possono essere semplicemente integrate in routine intelligenti di analisi delle immagini automatizzate.