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Il panorama dell'imaging per neurobiologia sta rapidamente cambiando per via dei progressi tecnici in settori consolidati come la chiarificazione dei tessuti e l’imaging multifotone in vivo, ma anche per l'emergere di nuove entusiasmanti tecnologie come l’optogenetica e la microscopia a super risoluzione. Nikon è impegnata nello sviluppo, nel perfezionamento e il supporto di tecnologie che consentono una ricerca di neurobiologia all'avanguardia.
Le microscopie multifotone sfruttano laser infrarossi ad alta potenza a impulsi di femtosecondi per eccitare la fluorescenza in profondità all'interno di campioni impegnativi. La densità di potenza richiesta per l'assorbimento di più fotoni viene realizzata solo nel focus del laser, limitando l'eccitazione a un piccolo volume focale e riducendo così al minimo la fluorescenza fuori fuoco. Combinata con la capacità della luce IR di penetrare mezzi fortemente dispersivi, l'imaging multifotone fornisce sia una maggiore profondità di penetrazione che un superiore sezionamento ottico, importante per l'imaging di tessuti spessi e disperdenti.
Immagine in vivo di un topo YFP-H anestetizzato (età: 4 settimane) con il metodo del cranio aperto.Visualizzazione dell’intero strato V dei neuroni piramidali e dei neuroni più profondi dell’ippocampo. Imaging profondo realizzato per l’imaging tridimensionale dei dendriti dell’ippocampo fino a 1,4 mm nel cervello.
Catturato con GaAsP NDD episcopico per 1300 nm e obiettivo CFI75 Apochromat 25XC W 1300 (NA 1.10, WD 2.0 mm)
Lunghezza d'onda di eccitazione: 1040 nm
Cortesia fotografica di Dott.i Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi e Tomomi Nemoto,
Istituto di ricerca per l’elettronica,
Università di Hokkaido
① Pyramidal cells in layer V
② White matter
③ Alveus
④ Hippocampal pyramidal cells
⑤ Hippocampus 3D zoom image
L'elettrofisiologia è lo studio delle proprietà elettriche di sistemi biologici, come i neuroni, usando microelettrodi per leggere e manipolare i segnali elettrici. L'accessibilità al campione è una priorità assoluta per gli elettrofisiologi poiché il posizionamento degli elettrodi richiede precisione a livello di micron. Il microscopio deve essere eccezionalmente stabile e non interferire con altri apparecchi di misurazione. Il microscopio dritto Nikon FN1 ha un profilo sottile e accessibile a forma di I per la massima accessibilità del campione e personalizzazione del sistema, perfetto per esperimenti di patch clamp. Il nostro portaobiettivi scorrevole per FN1 rende facile la retrazione e il cambio di obiettivi evitando collisioni con strumenti sensibili. La nostra serie di obiettivi CFI60 Water Dripping offre angoli di approccio del manipolatore ripidi, alta NA, lunghe distanze di lavoro e punte in ceramica inerti.
L’optogenetica è una famiglia di tecniche sperimentali che forniscono un controllo dei processi biologici attraverso la luce, tra cui la stimolazione di singoli neuroni che esprimono rodopsine di canale esogene. Inoltre, i reporter ottici come il calcio fluorescente e i sensori di voltaggio possono essere utilizzati per leggere l'attività in un esperimento progettato interamente per ottiche. Tuttavia il controllo della distribuzione spaziotemporale della stimolazione deve essere preciso ed indipendente dall'illuminazione di lettura. La stimolazione optogenetica a pattern si ottiene con massima robustezza utilizzando un Digital Micromirror Device (DMD), una serie di centinaia di migliaia di specchi in micro-scala controllabili indipendentemente. Nikon offre molteplici soluzioni DMD e dispositivi di stimolazione point-scanning per la ricerca optogenetica * .
Leggi la nostra nota di applicazione sull’optogenetica per informazioni sull'utilizzo di DMD per controllare la segnalazione in embrioni in sviluppo.
* I prodotti disponibili possono variare a seconda dell'area del mondo.
Le tecniche di chiarificazione e abbinamento di indice di rifrazione (RI) come CLARITY hanno cambiato radicalmente il modo in cui ci avviciniamo all'immagine dei tessuti. In precedenza, i ricercatori avrebbero tagliato meccanicamente tessuti di grandi dimensioni e in seguito eseguito imaging sulle singole sezioni. Questo approccio sfortunatamente richiede molto tempo e rompe il contesto 3D del campione, nascondendo relazioni fondamentali. La chiarificazione dei tessuti consente di caratterizzare rapidamente la struttura tridimensionale continua di campioni interi, fornendo più informazioni di prima. Tuttavia, l'imaging ottimale dei tessuti chiarificati richiede ottiche specializzate caratterizzate da un basso ingrandimento, un'elevata apertura numerica e la capacità di regolare le correzioni ottiche nell'obiettivo per diversi indici di rifrazione corrispondenti a diversi metodi di chiarificazione. Nikon ha recentemente introdotto due nuovi obiettivi per microscopio per rispondere a queste esigenze:
A differenza di microscopie standard limitate da diffrazione, le tecniche di super risoluzione forniscono una risoluzione a livello sub-organellare. I dettagli cellulari ultrastrutturali precedentemente osservati solo mediante microscopia elettronica (EM) sono stati risolti mediante super-risoluzione e con la specificità molecolare superiore e la capacità di multiplexing dell'imaging a fluorescenza. La microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM) utilizza il concetto di localizzazione di singole molecole per individuare singoli eventi di emissione di fluorescenza con precisione di un singolo nanometro. Questa tecnica è stata utilizzata per scoprire sia la struttura periodica del citoscheletro degli assoni (non osservabile da EM) che l'architettura dell'impalcatura del segmento iniziale degli assoni. Diversi gruppi di ricerca hanno applicato STORM per quantificare la distribuzione delle proteine sinaptiche. Nikon rende la tecnica STORM accessibile ai neuroscienziati tramite il nostro sistema N-STORM 5.0 . Inoltre, con il nostro sistema di illuminazione strutturato N-SIM S è ora possibile eseguire rapidamente immagini a super-risoluzione fino a 15 fotogrammi al secondo.
Christophe Leterrier Ph.D., NeuroCyto, Marseille, France
Il software NIS-Elements offre un controllo completo dell'acquisizione, dell'analisi e della visualizzazione dei dati. Le applicazioni di neurobiologia richiedono spesso di lavorare con campioni di grandi dimensioni. NIS-Elements semplifica l'esecuzione di scansione/stitching di immagini di grandi dimensioni e z-stacking, rendendo più semplice l'acquisizione di grandi dataset 3D (e 4D). Potenti strumenti di visualizzazione forniscono immagini straordinarie per la condivisione e la presentazione dei dati. Gli strumenti di programmazione grafica come JOB semplificano i flussi di lavoro di acquisizione e analisi personalizzati, compresi i flussi di lavoro condizionali avanzati (ad es. acquisizioni automatizzate che dipendono dai risultati dell'analisi). Le lunghe fasi di analisi come la segmentazione delle immagini possono essere semplicemente integrate in routine intelligenti di analisi delle immagini automatizzate.