Adquisición de imagened de tejido y organismo completo

La obtención de imágenes en profundidad en organismos, órganos y tejidos completos es uno de los mayores desafíos que se le presentan al microscopista óptico. Las muestras biológicas son entornos ópticamente imperfectos: dispersan tanto la iluminación como la luz de detección. La dispersión y varias aberraciones ópticas empeoran progresivamente a medida que aumenta la distancia dentro de la muestra, lo que en última instancia impone un límite práctico a la profundidad donde pueden capturarse las imágenes.

Productos para la obtención de imágenes de tejidos y organismos completos

**Pez cebra embrionario**

20X LWD 1.0 NA WD 2.8mm Cortesía de Erika Driekorn y la Dra. Beth Roman, Departamento de Genética Humana, Facultad de Salud Pública de la Universidad de Pittsburgh.

La solución líder de Nikon para aplicaciones de captura de imágenes en profundidad es el sistema de microscopio multifotónico AX R MP. Este sistema admite longitudes de onda de excitación de hasta 1300 nm, lo que permite obtener imágenes a una profundidad de hasta 1,4 mm en la muestra. También es posible escanear simultáneamente con dos haces, lo que acelera la adquisición de imágenes multifotónicas multicolores.

Para obtener imágenes a profundidades de hasta unos pocos cientos de micrómetros (µm), Nikon ofrece el sistema de microscopio confocal AX / AX R. La detección confocal con un solo diafragma, como en el AX/AX R, permite un mayor rechazo de la luz fuera de foco y un mayor seccionamiento óptico en comparación con los instrumentos confocales que utilizan una matriz de diagfragmas.

El sistema confocal de barrido de campo CSU-W1 de Yokogawa está optimizado para obtener imágenes de especímenes más grandes que la mayoría de los instrumentos de barrido de campo, y presenta un espacio más amplio entre los diafragmas del disco giratorio para reducir la diafonía, una función útil para aplicaciones de imágenes profundas.

●: Incluido, ⚬: Opcional

Bases de microscopio compatibles	AX R MP	AX / AX R	CSU-W1
	AX R MP Sistema de microscopio multifotónico	AX / AX R Microscopios confocales	CSU-W1 Escáner confocal de barrido de campo
Campo de visión	22 mm diagonal (cuadrado)	25 mm diagonal (cuadrado)	17 x 16 mm (rectangulares)
Límite de profundidad de imagen relativa	~ 1,4 mm (con excitación de 1300 nm)	~ 100 – 500 μm	~ 50 – 100 μm
Produce imágenes con velocidad de video	Sí (30 FPS con escaneo de 512 x 512)	Sí (30 FPS con escaneo de 512 x 512; solo AX R)	Sí (limitado por el sistema de cámara y la velocidad de rotación del disco)
Opciones de detección	Detectores no descaneados (NDDs) de GaAsP, hasta 4 canales.	Detectores de tubo fotomultiplicador (PMT) de GaAsP y multi-álcali disponibles. Hasta 4 canales.	Se recomiendan cámaras monocromáticas sCMOS o EM-CCD. Opciones de multi-cámara y divisor de cámara disponibles.
ECLIPSE Ti2-E Invertidos	yes	yes	yes
ECLIPSE Ti2-A Invertidos	no	no	yes
ECLIPSE Ti2-U Invertidos	no	no	yes
ECLIPSE Ni-E Invertidos	no	yes	yes
ECLIPSE Ni-U Invertidos	no	no	yes
FN1 Verticales	no	yes	yes
AX-FNGP Verticales	yes	no	no
AX-FNSP Verticales	yes	no	no

Discusión sobre la captura de imágenes de tejidos y organismos completos

Clareado de tejido

Circuito auditivo del tronco encefálico de pollo limpiado con el protocolo CUBIC. (E17) Tinte: Tetbow (transactivador de tetraciclina Brainbow) CFI Plan Apochromat 10XC Glyc Dr. Ryo Egawa, Dr. Hiroshi Kuba Escuela de Graduados en Fisiología Celular de Medicina Universidad de Nagoya

Clareado óptico de tejidos y lentes de objetivo compatibles

El renovado desarrollo de los métodos de clareado óptico para aumentar la transparencia de los tejidos biológicos ha permitido una mejor observación de muestras más grandes y complejas. De manera relacionada, los métodos de preparación de muestras de microscopía de expansión de superresolución aumentan físicamente el tamaño de la muestra, generalmente en un factor de ~4 a 10X o más, y por lo tanto también exigen instrumentos adecuados para la captura de imágenes en profundidad.

Al observar muestras gruesas con un microscopio, es de suma importancia minimizar la diferencia entre el índice de refracción de la muestra y el del medio de inmersión para mitigar mejor la aberración esférica, que limita la calidad de la imagen y la distancia de trabajo utilizable. Nikon ofrece lentes de objetivo para obtener imágenes de especímenes aclarados que se pueden sumergir directamente en una variedad de medios de clareado e incluyen collares de corrección para el índice de refracción (RI). Estos objetivos también cuentan con largas distancias de trabajo, altas aperturas numéricas y más.

Nikon también produce sus lentes de objetivo de la serie de inmersión en silicona, la serie de inmersión en agua CFI75 y la serie de objetivos Lambda S (la última categoría incluye varias lentes de inmersión en agua). Las lentes que utilizan inmersión de silicona, agua y glicerina son generalmente más fáciles de combinar con los medios comunes de limpieza y montaje, que generalmente tienen un RI menor que el aceite pero mayor que el aire.

Obtención de imágenes *in vivo* de un ratón YFP-H anestesiado (4 semanas de edad) mediante el método de cráneo abierto. Visualización de las neuronas piramidales de toda la capa V y las neuronas hipocampales más profundas. La captura de imágenes en profundidad para imágenes tridimensionales de las dendritas del hipocampo se obtiene hasta 1,4 mm en el cerebro.
Capturado con GaAsP NDD episcópico para 1300 nm y lente de objetivo CFI75 Apochromat 25XC W 1300 (NA 1.10, WD 2.0 mm), longitud de onda de excitación: 1040 nm
Fotografiado con la colaboración de: Dres. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi y Tomomi Nemoto, Instituto de Investigación de Ciencias Electrónicas, Universidad de Hokkaido

Estrategias de iluminación para obtener imágenes a más profundidad

Hay estrategias más allá del filtrado espacial de la luz, como con un microscopio confocal, para mejorar la capacidad de obtener imágenes a más profundidad. Un enfoque, que se puede implementar en cualquier microscopio de fluorescencia, es utilizar marcadores con espectros de emisión y excitación más desplazados hacia el rojo. La luz de longitud de onda más larga se dispersa menos y, por lo tanto, es adecuada para obtención de imágenes en profundidad. La captura de imágenes de espectro de infrarrojo cercano y rojo lejano (NIR) son posibles en las series de instrumentos confocales AX / AX R y CSU-W1.

Los beneficios de usar iluminación de longitud de onda más larga se agravan cuando se combinan con la excitación multifotónica: el proceso mediante el cual un fluoróforo que generalmente se excita con un fotón de una energía/longitud de onda determinada puede ser excitado por dos o más fotones de longitud de onda más larga con una energía total similar. Este proceso es casi inexistente en la naturaleza, ya que la probabilidad de que un fluoróforo absorba múltiples fotones de la energía correcta casi en el mismo instante es extremadamente baja.

En la práctica, lograr la excitación multifotónica requiere un láser pulsado de femtosegundos de muy alta potencia, e incluso así la densidad de potencia es lo suficientemente alta como para excitar solo la fluorescencia en el foco del haz. Básicamente, esto elimina la excitación de fluorescencia fuera de foco y más o menos evita la necesidad de un diafragma para filtrar la emisión fuera de foco. Si bien aún se puede usar un diafragma para ayudar a mejorar el seccionamiento óptico, generalmente es deseable maximizar la señal detectada, ya que la dispersión y otros problemas persisten.

Glosario

Bases de microscopio compatibles: Se refiere a los modelos de base de microscopio Nikon que son compatibles con cada sistema.
Campo de visión: El campo de visión del sistema, también denominado número de campo, es el diámetro del área de imagen con un aumento nominal de 1X.
Límite de profundidad de imagen relativa: Esto indica el rango de profundidad Z (axial) aproximado dentro del cual el sistema indicado puede producir imágenes con suficiente calidad de corte óptico y relación señal/ruido. Este valor puede ser bastante variable y depende en gran medida de las propiedades ópticas de la muestra y el recipiente, así como del etiquetado.
Opciones de detección: Los sistemas confocales y multifotónicos de barrido de puntos generalmente utilizan detectores de un solo elemento, como tubos fotomultiplicadores (PMT), mientras que los instrumentos confocales de barrido de campo utilizan cámaras digitales.
Produce imágenes con velocidad de video: El “Video rate” se define tradicionalmente como unos 30 fotogramas por segundo (FPS). La tasa de adquisición de imagen óptima depende de la aplicación exacta y puede ser más rápida o más lenta que 30 FPS. Las cámaras EM-CCD normalmente pueden generar imágenes de hasta 60 FPS (fotograma completo) y las cámaras sCMOS de hasta 40-100 FPS (fotograma completo).