Foco em virologia

Movie courtesy of Rudolph Reimer, Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology

Estamos acompanhando de perto a situação da COVID-19 (coronavirus), seguindo as orientações dos Centers for Disease Control and Prevention (Centros de Controle e Prevenção de Doenças) e das autoridades em saúde federais, estaduais e locais. Saiba mais sobre as medidas que estamos tomando.

 

Tecnologia para captura de imagens e quantificação da atividade de vírus em tempo real

O tamanho extremamente pequeno dos vírus (5-300 nm) torna desafiador o estudo de sua estrutura e função. Nos últimos séculos, inúmeros vírus foram descobertos e vacinas contra eles foram desenvolvidas, mas apenas com a invenção do microscópio eletrônico em 1931, a complexa estrutura viral foi revelada pela primeira vez. Desde então, as técnicas de microscopia de luz, como a captura de imagens por fluorescência, passaram a desempenhar papéis importantes em pesquisa de virologia, permitindo que a atividade de vírus seja estudada em sistemas vivos. A Nikon é uma fabricante líder em sistemas avançados de microscopia óptica para captura de imagens da atividade de vírus em tempo real, com alta resolução e alto rendimento. Dada a crescente importância da análise rápida e confiável da atividade de vírus, a Nikon está mais comprometida do que nunca com o desenvolvimento e suporte de sistemas avançados para esse trabalho.

Captura de imagem de células vivas

Uma ampla gama de recursos da Nikon contribui para a captura bem-sucedida de imagens de lapso de tempo, por longos períodos, de processos virais com fotodegradação mínima. Esses recursos incluem a microscopia confocal de alta velocidade e campo amplo, tecnologia de software baseada em inteligência artificial (IA) e sistema de bloqueio de foco em tempo real (Sistema de Foco Perfeito; do inglês Perfect Focus System, PFS).

O microscópio invertido de campo amplo ECLIPSE Ti2 é uma plataforma poderosa para captura de imagens de células vivas e partículas virais em virologia. Seu incomparável campo de visão (FOV) de 25 mm captura alterações e reações tanto de células quanto de vírus em uma ampla área em uma única foto. O Sistema de Foco Perfeito (PFS) evita o desvio focal, mantendo as células que se movimentam e os vírus em foco constante, suportando, portanto, a captura de imagens de alta resolução durante aquisições de alta velocidade e longo período.

Os microscópios confocais A1R HD25, CSU-W1 SoRa e Crest X-Light V3 têm um FOV de até 25 mm, que é quase o dobro dos microscópios confocais convencionais. Isso permite que mais dados sejam coletados em uma única imagem, resultando em maior eficiência. A observação em tempo real de atividades virais em células vivas também é possível utilizando-se a microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total (do inglês Total Internal Reflection Fluorescence, TIRF), cujos módulos podem ser instalados no microscópio invertido Ti2. A TIRF permite o estudo de processos próximos à membrana celular que possuem uma relação sinal-ruído excepcionalmente alta, como o mecanismo de entrada viral nas células e seu impacto nas interações célula-célula. A resolução aprimorada é obtida no confocal de disco giratório CSU-W1 SoRa usando o conceito de reatribuição óptica de fótons. O confocal de disco giratório Crest X-Light V3 fornece iluminação homogênea sobre um amplo FOV de 25 mm.

A fototoxicidade e a fotodegradação de sondas fluorescentes utilizadas para a marcação de vírus podem ser minimizadas usando o scanner ressonante de alta velocidade do A1R HD25. O poder do microscópio confocal A1R HD25 está na combinação do scanner ressonante de alta definição e amplo campo de visão de 25 mm, que fornece alto rendimento. Todas os recursos de captura de imagem de células vivas da Nikon incorporam o NIS-Elements, auma plataforma de software unificada de aquisição e análise, que agora oferece suporte aos módulos de aprendizagem profunda NIS.ai da Nikon, incluindo Clarify.ai, Denoise.ai e Enhance.ai.

Clarify.ai remove automaticamente o borrão de imagens de fluorescência de campo amplo, utilizando uma rede neural pré-treinada. O Denoise.ai remove o ruído de disparo de Poisson dos dados confocais ressonantes, em tempo real ou pós-aquisição, também utilizando uma rede neural pré-treinada. Quando combinado com o microscópio confocal A1R HD25, o Denoise.ai permite que os usuários adquiram rapidamente imagens com relação sinal-ruído baixas, que normalmente exigiriam tempos de permanência mais longos para serem resolvidos de forma adequada. O Enhance.ai é útil para captura de imagem de vírus utilizando baixa intensidade de fluorescência, que é necessária para detecção de marcadores sensíveis à luz, presentes em números baixos. A rede neural é treinada utilizando dados de imagem com relações sinal-ruído altas e baixas combinadas, permitindo predizer rapidamente versões relação sinal-ruído altas em imagens subsequentes.

Estudo de caso:

O transporte e a propagação do herpesvírus alfa em culturas neuronais foram estudados pela equipe do Dr. Lynn Enquist, na Universidade de Princeton, EUA, utilizando uma plataforma de captura de imagem de campo amplo de células vivas da Nikon (o microscópio invertido Eclipse Ti controlado pelo software NIS-Elements). Seu trabalho aplica a captura de imagens em tempo real e imagens de lapso de tempo de um dia para o outro, de vírus que expressam proteínas fluorescentes, revelando, assim, o processo de montagem dos vírus durante a infecção de neurônios primários. Sua abordagem também minimiza o impacto da captura de imagens de fluorescência no vírus.

(Taylor, M.P. et al. (2013) J. Vis. Exp. (78), e50723, doi:10.3791/50723).

Triagem de alto conteúdo

Quando a triagem clínica em grande escala é necessária (como no teste de drogas), há uma quantidade considerável de dados de imagens multidimensionais produzidos em um curto espaço de tempo. A Nikon fornece uma plataforma de triagem de células de alto conteúdo (BioPipeline Live), uma ferramenta de programação visual (JOBS) e uma ferramenta de análise de alto desempenho (GA3), para agilizar e automatizar seu fluxo de trabalho de captura de imagens de vírus.

A plataforma de captura de imagens de células vivas de alto conteúdo da Nikon, BioPipeline Live, oferece um ótimo recurso para captura totalmente automatizada de imagens de células vivas em várias placas. Utilizando todas as funcionalidades do microscópio invertido

ECLIPSE Ti2 o BioPipeline Live inclui automação robótica para captura rápida de imagens e troca de até 44 placas!

A ferramenta General Analysis 3 permite a implementação simples de análises complexas de pós-processamento. As imagens incluem metadados completos, mesmo para configurações como condição ambiental, que podem ser cruciais para estudos de vírus.

Além de todas as funções de análise e processamento que o NIS-Elements oferece, o módulo JOBS oferece a capacidade de criar protocolos experimentais personalizados, incluindo fluxos de trabalho condicionais. Isso permite a realização da aquisição e análise totalmente automatizadas, incluindo placas múltiplas. Também inclui a visualização imediata de dados de medição, poço a poço, por meio de um mapa de calor, para observação de tendências e análise posterior. O rendimento pode ser aumentado, junto com a viabilidade da amostra, utilizando os módulos de aprendizagem profunda NIS.ai, disponíveis para o software NIS-Elements. Por exemplo, Segment.ai aplica uma rede neural para segmentar automaticamente suas imagens (uma vez treinado). O JOBS pode agilizar e automatizar toda a plataforma, integrando funções, como controle de dispositivos, aquisição de imagens, processamento e análise, sem a necessidade de conhecimentos avançados de programação.

Estudo de caso:

O grupo de pesquisa do Dr. Vibor Laketa, na Universidade de Heidelberg, Alemanha, desenvolveu recentemente um teste semiquantitativo de anticorpos SARS-CoV-2 para uso em soro humano. Esse teste, baseado em microscopia, foi demonstrado utilizando o microscópio de campo amplo Nikon ECLIPSE Ti2, controlado pelo módulo JOBS no software NIS-Elements para adquirir automaticamente imagens em placas de 96 poços. Esse novo teste demonstra sensibilidade e especificidade melhoradas em comparação a um teste de diagnóstico de ELISA padrão, e alto rendimento, que é necessário para grandes programas de triagem.

(Pape, C. et al. (2020) bioRxiv (pré-print doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.15.152587)).

Super-resolução

Captura de imagem de super-resolução da estrutura e atividade viral

As partículas virais variam muito em tamanho, abrangendo aproximadamente de 5 a 300 nm de diâmetro, o que se aproxima ao limite de resolução da microscopia de fluorescência convencional. Por centenas de anos, a microscopia óptica só conseguia determinar detalhes celulares em aproximadamente 200 nm em XY e 500 nm em Z. Entretanto, novas técnicas de super-resolução tiveram sucesso em determinar detalhes biológicos em cerca de 20 nm em XY e 50 nm em Z, tornando possível investigar microorganismos pequenos e, às vezes, raros (incluindo vírus), com detalhes de nível quase molecular. Essas técnicas de super-resolução ajudam a preencher a lacuna entre a microscopia de fluorescência convencional e a microscopia eletrônica.

A Nikon oferece uma variedade de sistemas de super-resolução para diferentes aplicações de captura de imagem. A Microscopia de Iluminação Estruturada (do inglês Structured Illumination Microscopy, SIM) oferece duas vezes a resolução de um microscópio de campo amplo típico em X, Y e Z, enquanto mantém alta velocidade de aquisição e requisitos flexíveis de preparação de amostra. A Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica (do inglês Optical Reconstruction Microscopy, STORM) oferece o maior nível de detalhe - resolução até 10x maior do que as técnicas convencionais.

A SIM utiliza o conceito de mistura de frequência para identificar informações de frequência de super-resolução na imagem. Isso funciona iluminando a amostra com vários padrões de frequência espacial conhecida e comparando como a imagem é modulada por cada padrão, com análises subsequentes revelando informações de frequência de super-resolução que não são diretamente observáveis e usando-as para calcular a imagem final. A velocidade de aquisição para o N-SIM S é de até 15 quadros por segundo, o que é possível utilizando um modulador de luz espacial (do inglês Spatial Light Modulator, SLM) para modulação de padrão e especialmente útil para visualizar a progressão rápida da atividade viral em células vivas. O N-SIM S pode ser implementado no mesmo suporte de microscópio que um sistema confocal. Essa abordagem correlativa permite a captura rápida de imagens confocais de grandes campos de visão, reservando a aquisição de super-resolução para regiões de interesse.

O microscópio de super resolução N-STORM move os limites da resolução óptica apenas "ligando" um pequeno número de fluoróforos não sobrepostos em uma amostra. Isso permite que a posição do centróide de eventos de emissão única seja identificada com alta precisão. A repetição desse processo em muitos quadros de captura de imagem permite que a imagem completa seja reconstruída em uma resolução sem precedentes, em aproximadamente 20 nm no XY e 50 nm nas direções Z. A lente de imersão de silicone 100x da Nikon (NA = 1,35) permite um desempenho 3D superior em culturas de células vivas e amostras mais espessas, pois corrige melhor a aberração esférica em meio aquoso.

Tal como acontece com todos os microscópios da Nikon, o software NIS-Elements é fundamental para a captura bem-sucedida de imagens, simplificando bastante a aquisição e análise de imagens de super-resolução.

Estudo de caso:

O Nikon Center of Excellence (CoE) no Heinrich Pette Institute (HPI), Hamburgo, Alemanha, é um centro de pesquisa e educação nos fundamentos e avanços da microscopia na investigação de vírus patogênicos humanos. Um estudo da HPI demonstrou as capacidades da tecnologia 3D STORM multicolor para imagens de super-resolução da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV). O STORM permitiu que a distribuição espacial do núcleo estrutural e da proteína do envelope E2 do HCV fosse visualizada em pequenas gotículas lipídicas na membrana do retículo endoplasmático de células infectadas. Essas áreas de colocalização têm um diâmetro de aproximadamente 100 nm e acredita-se que representem locais de montagem viral.

(Eggert, D. et al. (2014) PloS ONE 9(7): e102511. Doi:10.1371/journal.pone.0102511).