Aquisição de Imagem de Tecidos e Organismos Inteiros

O desenvolvimento de métodos de clareamento óptico para aumentar a transparência de tecidos biológicos permitiu uma melhora na observação de amostras maiores e mais complexas. Da mesma forma, os métodos de preparação de amostras para microscopia de super-resolução de expansão aumentam fisicamente o tamanho da amostra, geralmente por um fator de ~ 4 a 10 vezes ou mais e, portanto, também exigem instrumentos adequados para a aquisição de imagens mais profunda.

Ao observar amostras espessas por meio de um microscópio, é de extrema importância minimizar a diferença entre o índice de refração da amostra e o índice de refração do meio de imersão, reduzindo, assim, a aberração esférica, que limita a qualidade da imagem e a distância útil de trabalho. A Nikon oferece lentes objetivas para aquisição de imagem de espécimes clarificadas, que podem ser imersas diretamente em uma variedade de meios de clarificação e incluem colar de correção para índice de refração (RI). Essas objetivas também apresentam longas distâncias de trabalho, altas aberturas numéricas e muito mais.

A Nikon também produz as lentes objetivas da série de imersão em silicone, série de imersão em água CFI75 e série Lambda S (a última categoria inclui várias lentes de imersão em água). As lentes que utilizam imersão em silicone, água e glicerina são geralmente mais fáceis de combinar com meios de clarificação e meios de montagem comuns, que geralmente têm um RI menor que o óleo, mas maior que o ar.

Existem estratégias além da filtragem espacial da luz, como em um microscópio confocal, que visam melhorar a capacidade de aquisição de imagens em maior profundidade na amostra. Uma abordagem, que pode ser implementada em qualquer microscópio de fluorescência, é a utilização de sondas com espectros de emissão e excitação mais deslocados para o vermelho. A luz de comprimento de onda mais longo é menos dispersa e, portanto, adequada para aquisição mais profunda de imagens. A aquisição de imagem no espectro do vermelho-distante e infravermelho-próximo (NIR) é possível nas séries de instrumentos confocais AX / AX R e CSU-W1.

Os benefícios do uso de iluminação de comprimento de onda mais longo são aumentados quando combinados com excitação multifóton – processo pelo qual um fluoróforo, que geralmente é excitado por um fóton de uma determinada energia/comprimento de onda, pode ser excitado por dois ou mais fótons de comprimentos de onda mais longos, com energia total semelhante. Esse processo é quase inexistente na natureza, pois a probabilidade de vários fótons com a energia correta serem absorvidos por um fluoróforo quase no mesmo instante é extremamente baixa.

Na prática, alcançar a excitação multifóton requer um laser pulsado de alta potência de femtossegundos – e mesmo assim a densidade de potência só é alta o suficiente para excitar a fluorescência no foco do feixe. Isso essencialmente elimina a excitação de fluorescência fora de foco e evita, de certa forma, a necessidade de abertura do pinhole para filtrar a emissão fora de foco. Embora a abertura do pinhole ainda possa ser utilizada para ajudar a melhorar o seccionamento óptico, geralmente é desejável maximizar o sinal detectado, visto que a dispersão e outros problemas permanecem.