Enfoque en virología

Movie courtesy of Rudolph Reimer, Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology

Nikon Europe BV y todas sus subsidiarias en Europa están vigilando estrechamente la situación con el COVID-19 (coronavirus) y siguiendo las directrices de las diferentes autoridades sanitarias locales. Aprenda más acerca de las medidas que hemos puesto en marcha.

 

Tecnología para la adquisición de imágenes y la cuantificación de la actividad vírica en tiempo real

El tamaño extremadamente pequeño de los virus (5-300 nm) hace que su estructura y función sean difíciles de estudiar. Durante los últimos siglos, se han descubierto muchos virus y se han desarrollado vacunas contra ellos, pero fue la invención del microscopio electrónico en 1931 lo que primero arrojó luz sobre su compleja estructura. Desde entonces, las técnicas de microscopía óptica, tales como las imágenes de fluorescencia, han crecido hasta desempeñar un papel importante en la investigación de virus, lo que permite estudiar su actividad en sistemas vivos. Nikon es un fabricante líder de sistemas avanzados de microscopía de luz para adquirir imágenes de actividad de virus en tiempo real con alta resolución y alto rendimiento. Dada la importancia cada vez mayor del análisis rápido y fiable de la actividad vírica , Nikon está más comprometido que nunca con el desarrollo y el soporte de sistemas avanzados para tal trabajo.

Captura de imágenes de células vivasl

La amplia gama de capacidades de Nikon contribuyen a la captura exitosa de imágenes a largo plazo y en intervalos de tiempo de procesos víricos con un fotoblanqueo mínimo, que incluye microscopía confocal y de campo amplio de alta velocidad, tecnología de software basada en inteligencia artificial (IA) y enfoque en tiempo real -sistema de bloqueo (Perfect Focus System, PFS).

El microscopio invertido de campo amplio ECLIPSE Ti2 es una plataforma potente para la captura de imágenes de células vivas en virología. Su incomparable campo de visión (FOV) de 25 mm captura cambios y reacciones de células y virus en un área amplia en una sola toma. El Perfect Focus System (PFS) evita la desviación focal, mantiene las células en movimiento y los virus enfocados constantemente y, por lo tanto, permite la captura de imágenes de alta resolución durante adquisiciones de alta velocidad y a largo plazo.

Los microscopios confocales A1 R HD25, CSU-W1 SoRa y Crest X-Light V3 tienen un campo de visión (hasta 25 mm) que es casi el doble que el de los microscopios confocales convencionales. Esto permite que se recopilen más datos en una sola imagen, lo que se traduce en una mayor eficiencia. La observación en tiempo real de las actividades víricas en células vivas también es posible utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), módulos para los cuales se pueden instalar en el microscopio invertido Ti2. TIRF permite el estudio de procesos cercanos a la membrana celular con una relación señal-ruido excepcionalmente alta, como el mecanismo de entrada viral en las células y su impacto en las interacciones célula-célula. La resolución mejorada se logra en el microscopio confocal de disco giratorio CSU-W1 SoRa utilizando el concepto de reasignación de fotones ópticos. El disco giratorio confocal Crest X-Light V3 proporciona una iluminación homogénea sobre un campo de visión amplio de 25 mm.

La fototoxicidad y el fotoblanqueo de los marcadores fluorescentes utilizados para teñir virus se pueden minimizar utilizando el escáner resonante de alta velocidad del A1R HD25.La fuerza del microscopio confocal A1R HD25 reside en la combinación del escáner resonante de alta definición con el gran campo de visión de 25 mm, que proporciona un alto rendimiento. Todas las plataformas de captura de imágenes de células vivas de Nikon incorporan NIS-Elements, una plataforma de software de adquisición y análisis unificada que ahora es compatible con los módulos de aprendizaje profundo NIS.ai de Nikon, incluidos Clarify.ai, Denoise.ai y Enhance.ai.

Clarify.ai elimina automáticamente el desenfoque de las imágenes de fluorescencia de campo amplio utilizando una red neuronal previamente entrenada. Denoise.ai elimina el ruido de disparo de Poisson de los datos obtenidos con el microscopio confocale de resonancia, ya sea en tiempo real o después de la adquisición, y también utilizando una red neuronal previamente entrenada. Cuando se combina con el microscopio confocal A1R HD25, Denoise.ai permite a los usuarios adquirir rápidamente imágenes de características de baja relación señal-ruido que normalmente requerirían tiempos de permanencia más largos para resolverse suficientemente. Enhance.ai es útil para la captura de imágenes de fluorescencia del poca intensidad de virus, que es necesaria para los marcadores de detección sensibles a la luz presentes en números bajos. La red neuronal se entrena utilizando datos de imagenes con señal a ruido alta y baja emparejados, lo que le permite predecir rápidamente versiones de señal a ruido alta de imágenes imporandas posteriormente.

Ejemplo:

El transporte y la propagación del virus alfaherpes en cultivos neuronales ha sido estudiado por el equipo de la Dra. Lynn Enquist en la Universidad de Princeton, EE. UU., utilizando una plataforma de captura de imágenes de campo amplio de células vivas Nikon (el microscopio invertido Eclipse Ti controlado por software de NIS-Elements). Su trabajo utiliza la captura de imágenes de células vivas en tiempo real y en lapso de tiempo durante la noche de virus que expresan fusiones de proteínas fluorescentes para estudiar el ensamblaje vírico durante la infección de neuronas primarias. Su planteamiento también minimiza el impacto de la captura de imágenes de fluorescencia en el virus.

(Taylor, M.P. et al. (2013) J. Vis. Exp. (78), e50723, doi:10.3791/50723).

Exploración de alto contenido

Cuando se requiere una exploración clínica a gran escala, como pruebas de detección de fármacos y virus, se produce una cantidad considerable de datos de imágenes multidimensionales en poco tiempo. Nikon proporciona una plataforma de detección de células de alto contenido (LIPSI), una herramienta de programación visual (JOBS) y un software de análisis de alto rendimiento (GA3) para agilizar y controlar el flujo de trabajo automatizado que permite una visualización confiable de la actividad del virus en un alto rendimiento.

La plataforma de exploración de células de alto contenido de Nikon, LIPSI, proporciona una gran solución parala exploración de células vivas totalmente automatizado en varias placas. Utilizando toda la funcionalidad del microscopio invertido Eclipse Ti2, LIPSI ofrece una automatización robótica para una detección rápida de alto contenido de hasta 20 placas de múltiples pocillos.

La herramienta General Analysis 3 (GA3) realiza el análisis de posprocesamiento más complejo con extrema facilidad. Los datos obtenidos con cada imagen incluyen todos los parámetros de captura de imágenes, lo que facilita la vinculación de los resultados del análisis con otros parámetros, como las condiciones ambientales, que pueden ser cruciales para los estudios de virus.

Además de todas las funciones de análisis y procesamiento que posee NIS-Elements, JOBS puede crear protocolos de experimentos personalizados. Estos se pueden ejecutar en varias placas con adquisición y análisis totalmente automatizados. Esto incluye la visualización inmediata de los datos de medición de cada pocillo y mediante un mapa de calor para la observación de tendencias y análisis adicionales. El rendimiento se puede aumentar junto con la viabilidad de la muestra utilizando los módulos de IA de NIS-Elements, como Convert.ai y Segment.ai, donde las redes neuronales se pueden entrenar para clasificar y segmentar sus imágenes. JOBS puede optimizar y automatizar toda la plataforma integrando funciones como control de portaobjetos, adquisición de imágenes, procesamiento, análisis y cálculo sin la necesidad de conocimientos avanzados de programación.

Ejemplo:

El grupo de investigación del Dr. Vibor Laketa en la Universidad de Heidelberg, Alemania, desarrolló recientemente una prueba semicuantitativa de anticuerpos contra el SARS-CoV-2 para su uso en sueros humanos. Esta prueba basada en microscopía se demuestra utilizando un microscopio de campo amplio Nikon ECLIPSE Ti2 controlado por el módulo JOBS en el software NIS-Elements para adquirir automáticamente imágenes en placas de 96 pocillos. Esta nueva prueba demuestra una sensibilidad y especificidad mejoradas en comparación con una prueba de diagnóstico estándar basada en ELISA, y con un alto rendimiento, que es necesario para grandes programas de detección.

(Pape, C. et al. (2020) bioRxiv (preimpresión doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.15.152587)).

Súper resolución

Captura de imágenes de súper resolución de la estructura y actividad viral

Las partículas virales varían mucho en tamaño, abarcando aproximadamente 5 a 300 nm de diámetro, que va desde cerca del límite de resolución y más allá de la microscopía de fluorescencia convencional. Durante cientos de años, la microscopía óptica solo ha podido resolver detalles celulares a aproximadamente 200 nm en XY y 500 nm en Z, pero las nuevas técnicas de superresolución han tenido éxito en la resolución de detalles biológicos a aproximadamente 20 nm en XY y 50 nm en Z. Esto permite investigar microorganismos pequeños y, a veces, raros (incluidos virus) con un nivel de detalle casi molecular. Estas técnicas de superresolución ayudan a crear puentes entre la microscopía de fluorescencia convencional y la microscopía electrónica.

Nikon ofrece una gama de sistemas de súper resolución para diferentes aplicaciones de captura de imágenes. La microscopía de iluminación estructurada (SIM) proporciona el doble de resolución que un microscopio de campo amplio típico en X, Y y Z mientras mantiene una alta velocidad de adquisición y requisitos de preparación de muestras flexibles. La microscopía estocástica de reconstrucción óptica (STORM) proporciona el mayor nivel de detalle, hasta 10 veces mejor resolución que las técnicas convencionales.

SIM utiliza el concepto de mezcla de frecuencias para identificar la información de frecuencia de superresolución en la imagen. Esto funciona iluminando la muestra con varios patrones de frecuencia espacial conocida y comparando cómo la imagen es modulada por cada patrón, con un análisis posterior que descubre información sobre frecuencias de superresolución que no son directamente observables y la utiliza para calcular la imagen final. La velocidad de adquisición del N-SIM S es de hasta 15 tomas por segundo, que es posible mediante el uso de un modulador espacial de luz (SLM) para la modulación de patrones, y es especialmente útil para visualizar la rápida progresión de la actividad vírica en células vivas. El N-SIM S se puede implementar en la misma base de microscopio que un sistema confocal. Este enfoque correlativo permite la captura rápida de imágenes confocales de grandes campos de visión, reservando la adquisición de superresolución para las regiones de interés.

El microscopio de superresolución N-STORM bate los límites de la resolución óptica con solo "encender" una pequeña cantidad de fluoróforos que no se superponen en una muestra. Esto permite identificar con alta precisión la posición del centroide de eventos de emisión única. La repetición de este proceso en muchos fotogramas de captura de imágenes permite reconstruir la imagen completa con una resolución sin precedentes, a aproximadamente 20 nm en las direcciones XY y 50 nm en las direcciones Z. La lente de inmersión de silicona 100x de Nikon (NA = 1,35) permite un rendimiento 3D superior en cultivos de células vivas y muestras más gruesas, ya que corrige mejor la aberración esférica en medios acuosos.

Al igual que con todos los microscopios de Nikon, el software NIS-Elements es fundamental para una captura de imágenes exitosa, lo que simplifica enormemente la adquisición y el análisis de imágenes de superresolución.

Exemplo:

El Centro de Excelencia Nikon (CoE) en el Instituto Heinrich Pette (HPI), Hamburgo, Alemania, es un centro de investigación y educación sobre los fundamentos y avances de la microscopía para la investigación de virus patógenos humanos. Un estudio en HPI demostró las capacidades de la tecnología multicolor 3D STORM para obtener imágenes de súper resolución de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC). STORM permitió visualizar la distribución espacial del núcleo estructural y la proteína de la envoltura E2 del VHC en pequeñas gotas de lípidos en la membrana del retículo endoplásmico en las células infectadas. Estas áreas de colocalización tienen un diámetro de aproximadamente 100 nm y se cree que representan sitios de ensamblaje viral.

(Eggert, D. et al. (2014) PloS ONE 9(7): e102511. Doi:10.1371/journal.pone.0102511).