Le principe de la microscopie de reconstruction optique stochastique
La microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) reconstruit une image de super-résolution en combinant les informations de localisation de haute précision de fluorophores individuels en trois dimensions et en plusieurs couleurs
N-STORM utilise l'activation stochastique d'un nombre relativement faible de fluorophores en utilisant une lumière de très faible intensité. Cette "activation" aléatoire stochastique des fluorophores permet la séparation temporelle de molécules individuelles, permettant une adaptation de haute précision de chaque image des fluorophores dans XY. En utilisant une optique 3D-STORM spéciale, N-STORM peut également localiser des molécules individuelles le long de l'axe Z avec une grande précision. La combinaison informatique des coordonnées moléculaires en trois dimensions permet d'obtenir des images 3D de super-résolution.
Détection de haute précision de la position sur l’axe Z d
En utilisant une lentille cylindrique qui condense de manière asymétrique des faisceaux lumineux dans la direction X ou Y, les emplacements des molécules sur l'axe Z peuvent être déterminés avec une précision d'environ 50 nm. L'emplacement sur Z est déterminé en détectant l'orientation de l'étirement induit par l'astigmatisme dans la direction X ou Y et la taille des images du point hors focus. Les images fluorescentes 3D peuvent être reconstruites en combinant les informations de localisation sur l'axe Z déterminées avec les informations de localisation sur l'axe XY.
Variété de sondes photosensible et d'approches d'étiquetage pour une précision de localisation élevée
Différents types de paires d’activateur-rapporteur et d'étiquettes sans activateur sont disponibles. L'approche par paire de colorants activateur-rapporteur fournit une précision de localisation cohérente entre les canaux en exploitant le même colorant rapporteur pour différents canaux. Chaque paire de colorants consiste en un colorant activateur et un colorant rapporteur, le colorant activateur régulant l'état d'activation du colorant rapporteur.
Les étiquettes sans activateur consistent uniquement en un colorant d'imagerie, ce qui permet des techniques simples de marquage et de préparation d'échantillons telles que l'immunofluorescence indirecte conventionnelle utilisant des anticorps conventionnels conjugués à un colorant.
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