Système d'éclairage modulaire avec une flexibilité et une possibilité d’extension.
Le système Nikon Ti2-LAPP fournit des illuminateurs modulaires pour la fluorescence par réflexion interne totale (TIRF), la photoactivation/conversion, le photoblanchiment et l'épifluorescence, ainsi que la microscopie à super-résolution (N-STORM). Chaque module peut être combiné de manière flexible pour construire des systèmes de microscope optimisés pour les besoins de recherche individuels. Par exemple, plusieurs modules TIRF peuvent être intégrés dans un seul microscope pour des expériences d'anisotropie et une imagerie TIRF rapide et multi-angle. Combiné avec la structure de strate du Ti2, jusqu'à cinq modules d'éclairage peuvent être incorporés dans un seul microscope (par exemple, deux TIRF, un FRAP, un DMD et un module Epi-FL peuvent tous être intégrés dans un Ti2).
Caractéristiques-clés
Module H-TIRF
Réglage TIRF entièrement automatisé et observation maintenant possibles
L'angle idéal d'incidence et la mise au point du laser pour l'observation TIRF varient en fonction de l'échantillon et des conditions d'observation. Le réglage de l'angle d'incidence et la mise au point pour atteindre la TIRF exige des compétences et de l'expérience. Le module H-TIRF règle automatiquement la mise au point et l'angle d'incidence du laser pour l'observation TIRF en surveillant le faisceau de réflexion. Cet ajustement automatique de la mise au point laser et le réglage de l’angle d’incident sont effectués par la fonction d’alignement automatiquedu logiciel Éléments NIS. Les angles d'incidence et la profondeur de pénétration des champs évanescents peuvent être enregistrés et reproduits pour des expériences ultérieures afin d'assurer des résultats d'imagerie cohérents.
Une préparation in vitro de microtubules marqués en fluorescence (tétraméthyl-rhodamine et Alexa 647) et des protéines de liaison de la tubuline (Alexa 488) a été capturée en trois longueurs d'onde différentes à l'aide de l'éclairage H-TIRF et du filtre de progression ND. Pour plusieurs longueurs d'onde, les angles d'incidence peuvent être ajustés automatiquement.
Image offerte par Melissa Hendershott et Dr. Ron Vale, Université de Californieof California, San Francisco
Sans le filtre de progression ND, l'éclairage TIRF affiche un profil gaussien dans le champ d'observation, et le centre est plus lumineux.
En utilisant un filtre de progression ND, un éclairage TIRF très homogène est obtenu.
Filtre d’élimination ND de gradation
Filtre d’entrée ND de gradation
Filtre d’élimination ND de gradation
Filtre d’entrée ND de gradation
Module TIRF motorisé
L'angle d'incidence du laser et la profondeur de pénétration correspondante du champ évanescent peuvent être contrôlés via le logiciel NIS-Elements. Lorsque plusieurs modules TIRF sont montés (voir image), la profondeur de pénétration peut être réglée indépendamment pour chaque longueur d'onde.
Module TIRF
Pour l'observation de la dynamique de la membrane cellulaire et des molécules simples
Le module TIRF manuel comprend un filtre ND à gradation (similaire au module H-TIRF), permettant un éclairage TIRF uniforme sur tout le champ de vision. Grâce à l'utilisation des caméras de haute sensibilité, il est possible de refléter des molécules individuelles et la dynamique des protéines dans et à proximité de la membrane cellulaire en utilisant cet éclairage TIRF.
Module N-STORM
Atteint une résolution 10 fois supérieure à la microscopie optique conventionnelle
Équipé d’une permutation motorisée du champ d’éclairage (1x, 2x, 4x), ainsi que d’une fonction d’alignement automatique, ce module permetimagerie de haute résolution N-STORM avec le système Ti2-LAPP. Cela offre une résolution d'image incroyable d'environ 20 nm, soit 10 fois ou plus que la limite de la microscopie optique conventionnelle. En utilisant la microscopie à résolution optique stochastique (STORM), il est possible de mieux comprendre les interactions protéine-protéine au niveau moléculaire.
Module DMD
Atteint de façon simultanée une photo-activation de multipoints
Le module DMD permet une photo-activation et une photo-conversion d'un modèle et des positions spécifiés par l'utilisateur alors que le FRAP classique permet uniquement la photo-activation d'un seul point manuellement positionné. La forme d'éclairage DMD, la taille, la position et le nombre peuvent être librement personnalisés en utilisant lelogiciel Éléments NIS. Cette capacité permet aux chercheurs de marquer de façon idéale un sous-ensemble de cellules ou de populations de protéines au sein d'une seule ou de plusieurs cellules afin de suivre leur comportement. Le module DMD est également parfaitement adapté pour des expériences optogénétiques dans lesquelles les ROI fortement personnalisées peuvent être utilisées pour optiquement induire des modifications fonctionnelles des sous-ensembles de cellules et de populations de protéines. Le module DMD peut être utilisé avec l'éclairage au laser ou par LED moins phototoxique.
Photoactivation
50 mins
63 mins
Fibroblastes embryonnaires d'une souris co-exprimant la lamine A marquée avec mCherry (rouge) et la lamine A photo-activable mais photo-convertie marquée avec GFP (vert) dans la région inférieure droite utilisant le module DMD et l'éclairage LED de 405 nm. Les images en accéléré ont été capturées à l'aide de l'illuminateur d'épifluorescence. Via la photo-activation d'une sous-population de protéines de lamine, il est possible d'observer la dynamique et le comportement des échanges de sous-unité.
Image offerte par les Dr : Takeshi Shimi et Bob Goldman, École de médecine universitaire de Northwestern
Module FRAP
Pour l'analyse de la dynamique intracellulaire des protéines
Avec ce module FRAP, des expériences de photoblanchiment et de photo-activation / conversion sont possibles et cela avecdes caméras de haute sensibilité et de haute fréquence. Ce module peut éclairer un point d'une positio- cible dans la cellule, en fournissant un moyen rentable pour l'étude de la dynamique des protéines intracellulaires, sans l'utilisation d'un microscope confocal à balayage de point.
Blanchiment
3 minutes
12 minutes
Un fibroblaste embryonnaire de souris exprimant la lamine A marquée avec mCherry était décoloré dans le coin supérieur droit du noyau lors de l’utilisation du module FRAP pour étudier la dynamique des molécules de lamine A. Les images en accéléré ont été acquises à l'aide de l'illuminateur à épifluorescence.
Image offerte par les Dr : Takeshi Shimi et Bob Goldman, École de Médecine de l’Université Northwestern
Module FL EPI pour grand champ de vision
Parfait pour l'imagerie en fluorescence avec des caméras avec de grands capteurs
Le module EPI FL pour grand champ de vision est un illuminateur d'épifluorescence de base pour le système Ti2-LAPP. Il est conçu pour les applications d'imagerie de FOV volumineuses utilisant des microscopes inversés Ti2. Il offre un champ de vision de 25 mm inégalé lors de l'observation enépifluorescence, même s'il est compact. Il est équipé d'une lentille à oeillet en quartz pour assurer une intensité uniforme sur tout le champ de vision et offre une transmittance élevée sur un large spectre, y compris les UV.
Combinaison flexible de modules
La modularité du système Ti-LAPP et la capacité de configuration flexible offrent des solutions d'imagerie personnalisées pour répondre aux besoins individuels de la recherche. Les modules peuvent également être facilement échangés ou ajoutés pour s'adapter à l'évolution des besoins expérimentaux, une caractéristique importante pour les laboratoires dotés d'orientations de recherche en constante évolution et des locaux comprenant plusieurs utilisateurs. Par exemple, en ajoutant un deuxième module TIRF à une seule configuration TIRF, les utilisateurs peuvent facilement réaliser des expériences en anisotropie et de rapides expériences TIRF à plusieurs angles. L'ajout d'un module de photo-activation / conversion tel que le module DMD ou FRAP permet de suivre les sous-populations de protéines, fournissant ainsi un aperçu des comportements protéiques qui seraient autrement illusoires lors de l'imagerie de la population entière.
Capacité de configuration à deux niveaux
Profitant de la structure par strate du Nikon Ti2, les modules peuvent être incorporés en deux couches distinctes avec plusieurs modules par couche. L'utilisation d'une configuration à double couche permet une configuration de filtre optimale de chaque module d'éclairage. Par exemple, en plaçant le module H-TIRF dans la couche inférieure et un module DMD dans la couche supérieure, des cubes defiltre spécifiques distincts pour l'imagerie TIR et la photo-activation peuvent également être utilisés simultanément dans leurs tourelles de filtre respectives qui se trouvent dans les couches inférieures et supérieures. Cette configuration permet une sélection de filtre optimale et améliore la précision expérimentale tout en maintenant des vitesses d'acquisition les plus élevées.
Cellule de Drosophila S2 exprimant la tubuline EOS. L'extrémité d'un microtubule individuel a été photo-convertie en utilisant le module DMD et une lumière DEL de 405 nm. Les images en accéléré en TIRF bicolore ont été acquises en utilisant l'éclairage H-TIRF. L'ajout de tubuline verte non convertie à l’extrémité en croissance du microtubule rouge photo-converti, et le raccourcissement (et l’éventuelle disparition) du segment photo-converti démontrent la propriété de l'instabilité dynamique des microtubules. Les flèches marquent les extrémités encroissance et en rétrécissement du microtubule photo-converti.
Image offerte pas les Dr : Nico Stuurman et Ron Vale, Université de Californie, San Francisco
Photostimulation & TIRF
- Ti2-LAPP
