Aquisição de Imagem de Células Vivas

É difícil mensurar a importância da microscopia de células vivas – particularmente da aquisição de imagem de fluorescência – para a pesquisa moderna em biologia celular. A aquisição de imagem de fluorescência de células vivas permite que a dinâmica e as interações de biomoléculas específicas sejam observadas por longos períodos de tempo. Inúmeras inovações tecnológicas nas últimas décadas contribuíram para que a aquisição de imagens em tempo real fosse amplamente empregada, incluindo o desenvolvimento de proteínas fluorescentes como marcadores específicos e expressos geneticamente. A aquisição de imagem de células vivas é normalmente realizada utilizando um microscópio invertido, que acomoda melhor os recipientes de cultura preenchidos com meio.

Produtos para Aquisição de Imagem de Células Vivas

Projeção de intensidade máxima de imagens em série Z de uma célula mitótica viva, adquiridas utilizando o scanner ressonante AX R operando a 15 FPS com resolução de pixel de 2048 x 1024. Objetiva: CFI Plan Apo Lambda 60X Oil, 1,4 NA.

O microscópio invertido motorizado ECLIPSE Ti2-E é o suporte de microscópio recomendado para aquisição de imagem de células vivas – ele pode ser combinado com todas as opções confocais e de super-resolução detalhadas aqui. O Sistema de Foco Perfeito 4 (PFS4, do inglês Perfect Focus System 4) é a tecnologia de travamento de foco líder do setor, que permite a aquisição de imagens de células vivas por longos períodos sem desvio focal e é compatível com recipientes de cultura tanto de vidro quanto de plástico. Um dispensador de água automático, para objetivas de imersão em água, também está disponível.

O sistema de iluminação modular Ti2-LAPP permite que um único microscópio seja combinado com até cinco módulos de iluminação diferentes, com opções disponíveis para TIRF, epifluorescência de campo amplo e fotoestimulação, incluindo dispositivos FRAP e dispositivos de microespelhos digitais (DMDs). É possível configurar vários módulos de iluminador TIRF em um único suporte, permitindo imagens multicanais simultâneas com o ângulo TIRF ideal para cada linha de laser.

Os microscópios confocais AX / AX R são as soluções confocais de varredura pontual da Nikon – com o AX R apresentando um sistema de varredura ressonante rápida, que permite aquisição de imagens a uma taxa de vídeo de 30 frames por segundo (FPS) com resolução de 512 x 512 pixels. Esse sistema suporta ainda o módulo de software Denoise.ai, que remove automaticamente o ruído de disparo – a principal fonte de ruído em imagens confocais de varredura ressonante.

Os sistemas confocais de disco giratório da série Yokogawa CSU constituem soluções populares para aquisição de imagem de células vivas. O CSU-X1 é o melhor modelo de CSU para imagens de alta velocidade devido à eficiência do caminho da luz e à rápida velocidade de rotação do disco. O CSU-W1 é mais adequado para aquisição de imagem de sistemas-modelo mais espessos, como organoides, uma vez que apresenta maior distância de separação (espaçamento) entre os pinholes, o que reduz a diafonia de sinal entre pinholes adjacentes, permitindo a aquisição de imagens mais profundas em amostras de dispersão.

A microscopia de super-resolução tem se tornado mais refinada e prática para aplicações de aquisição de imagem de células vivas. O sistema de microscopia de iluminação estruturada de super-resolução N-SIM S aproveita a iluminação estruturada de super-resolução rápida, estilo Gustafsson, para dobrar a resolução óptica em comparação à microscopia de campo amplo convencional, sendo, ainda, capaz de adquirir imagens a uma taxa de até 15 FPS. Os modos 2D-SIM, 3D-SIM e TIRF-SIM estão todos disponíveis. O Yokogawa CSU-W1 SoRa é um instrumento confocal de disco giratório que integra um disco de microlente de emissão para obter super-resolução por reatribuição de pixel óptico.

●: Incluído, ⚬: Opcional

ECLIPSE Ti2-E
Microscópio invertido (imagem de campo amplo)*
AX R
Sistema confocal ressonante
CSU-X1
Scanner confocal de disco giratório
CSU-W1
Scanner confocal de disco giratório
Ti2-LAPP
E-TIRF
Iluminador
N-SIM S
Sistema de super-resolução
CSU-W1 SoRa
Sistema de super-resolução de disco giratório
Limite relativo de profundidade da aquisição de imagem ~ 5 μm
~ 15 – 25 μm (com deconvolução)
~ 100 – 500 μm ~ 50 μm ~ 50 – 100 μm ~ 100 – 300 nm ~ 10 – 20 μm ~ 50 – 100 μm
Supports Video Rate Imaging

sim
(limitado pelo sistema de câmera)

sim
(30 FPS com varredura de 512 x 512)

sim
(limitado pelo sistema de câmera e velocidade de rotação do disco)

sim
(limitado pelo sistema de câmera e velocidade de rotação do disco)
sim
(limitado pelo sistema de câmera)
não
(apenas 15 FPS com 2D-SIM e TIRF-SIM)
sim
(limitado pelo sistema de câmera e velocidade de rotação do disco)
Campo de visão 25 mm diagonal (circular) 25 mm diagonal (quadrado) 10 x 7 mm (rectangular) 17 x 16 mm (rectangular) ~ 10 mm diagonal (circular) ~ 9.3 mm diagonal (circular) 17 x 16 mm (rectangular)
Modalidades de aquisição de imagem suportadas ECLIPSE Ti2-E AX R CSU-X1 CSU-W1 Ti2-LAPP E-TIRF N-SIM S CSU-W1 SoRa
Campo claro yes no no no no no no
Confocal - varredura de ponto no yes no no no no no
Confocal - disco giratório no no yes yes no no yes
Campo escuro yes no no no no no no
Contraste de interferência diferencial (DIC) yes no no no no no no
Contraste de modulação avançado da Nikon (NAMC) yes no no no no no no
Contraste de fase yes no no no no no no
Super-resolução - iluminação estruturada no no no no no 2D-SIM, TIRF-SIM, 3D-SIM
Super-Resolution - Optical Pixel Reassignment Microscopy no no no no no no yes
Fluorescência de reflexão interna total (TIRF) no no no no yes no no
Contraste de volume yes no no no no no no
Fluorescência de campo amplo yes no no no no no no
Suportes de microscópios compatíveis ECLIPSE Ti2-E AX R CSU-X1 CSU-W1 Ti2-LAPP E-TIRF N-SIM S CSU-W1 SoRa
ECLIPSE Ti2-E invertido no yes yes yes yes yes yes
ECLIPSE Ti2-A invertido no no yes yes no no yes
ECLIPSE Ti2-U invertido no no yes yes no no yes
ECLIPSE Ni-E vertical no yes yes yes no no no
ECLIPSE Ni-U vertical no no yes yes no no no
ECLIPSE FN1 vertical no yes yes yes no no no

*Esta linha refere-se apenas ao uso do ECLIPSE Ti2-E para aquisição de imagem de campo amplo. O Ti2-E é o suporte de microscópio recomendado para uso em conjunto com os outros sistemas listados na tabela.

Discussão de Aquisição de Imagem de Células Vivas

Lentes objetivas da série de imersão em silicone da Nikon. Cada uma dessas lentes fornece alta NA, longa distância de trabalho e um colar de correção com configurações dependentes de temperatura.

A arte e a ciência da aquisição de imagem de células vivas

A aquisição de imagem de células vivas exige que os usuários equilibrem cuidadosamente as condições de aquisição – o objetivo é coletar os dados essenciais mínimos, reduzindo a perturbação do sistema-modelo. Embora possa ser tentador utilizar maior potência de iluminação, exposição mais longa da câmera, etc., para obter imagens com maior relação sinal-ruído (S/R), é importante entender que a fototoxicidade pode comprometer a integridade fisiológica e a viabilidade contínua do sistema. Além disso, o fotobranqueamento impõe um limite prático de quantos fótons podem ser extraídos de cada fluoróforo ao longo do experimento.

Um aspecto crucial dos experimentos de aquisição de imagem em tempo real diz respeito ao controle das condições ambientais – manutenção da mistura de gás, temperatura e umidade corretas para o sistema em questão. Isso pode ser alcançado utilizando uma inserção menor no topo da platina, para incubação, ou um sistema de gabinete maior, envolvendo a maior parte do microscópio. Tanto as inserções na parte superior da platina quanto os gabinetes maiores, projetados para microscópios Nikon, estão disponíveis nos principais fabricantes terceirizados.

Outro fator que deve ser considerado é a escolha da lente objetiva. As lentes objetivas de imersão em óleo de alta abertura numérica (NA) podem funcionar bem para recursos de aquisição de imagem próxima à lamínula, em células planas, mas sofrem de aberração esférica na aquisição de imagem mais profunda na amostra. Isso se deve ao menor índice de refração (RI) da célula/meio de cultura em comparação com o vidro/óleo. Para aplicações de aquisição de imagem mais profunda e 3D, é recomendável utilizar objetivas que empregam um meio de imersão correspondente ao RI do ambiente da amostra, como água ou silicone.

A série de objetivas CFI Apochromat Lambda S inclui várias lentes objetivas de imersão em água, incluindo a CFI Plan Apochromat IR 60XC WI, que tem a NA mais alta conhecida para uma objetiva de imersão em água (NA = 1,27). A Nikon lançou mais recentemente suas lentes objetivas da série de imersão em silicone. O silicone tem um RI de cerca de 1,4, correspondendo mais proximamente ao RI do ambiente celular, o que permite NAs mais altas do que a imersão em água. Essas objetivas são adequadas para aquisição de imagem de sistemas de cultura 3D, como organoides.

O acionamento por hardware melhora significativamente o tempo geral do experimento. Na maioria desses exemplos, o tempo de exposição da câmera foi maior que o tempo de leitura da câmera.

a A última linha apresenta uma comparação para a qual o tempo de exposição da câmera foi igual ao tempo de leitura e a câmera foi capaz de funcionar no modo sobreposto (ciclo de trabalho de 100%).

Minimizando a fototoxicidade e fotobranqueamento em células vivas

A irradiação intensa exigida pelas técnicas de aquisição de imagem baseadas em fluorescência é inerentemente prejudicial à saúde das células, especialmente os comprimentos de onda de alta energia (deslocados para o azul). Por esta razão, é recomendado o uso de fluoróforos na região do vermelho a infravermelho-próximo, embora o uso continuado de fluoróforos populares na região do verde, como EGFP, seja bastante comum e continue a funcionar bem para muitas aplicações de aquisição de imagem multicolorida.

A maioria dos microscópios utiliza o acionamento dos dispositivos do sistema através de software. No entanto, isso pode ser um pouco lento devido à relativa imprecisão do relógio do computador e às verificações e chamadas de retorno necessárias dos estados do dispositivo. Por outro lado, o acionamento por hardware utiliza o relógio altamente preciso da câmera para coordenar os dispositivos, enquanto ignora as chamadas de retorno, maximizando a velocidade do sistema e minimizando a dose de fótons. Os dispositivos acionados podem incluir platinas Z piezo, iluminadores a laser/LED e até mesmo dispositivos personalizados com capacidade de comunicação de E/S.

O acionamento também permite padrões de iluminação mais complexos. Por exemplo, é possível utilizar o software Nikon NIS-Elements para iluminar a amostra somente quando todos os pixels de uma câmera sCMOS estiverem expostos (considerando o efeito rolling shutter) – diminuindo a dose de fótons e a fotodegradação em comparação com a iluminação contínua e aquisição de imagem livre. Também é possível, durante a exposição, pulsar a iluminação em uma escala de tempo de microssegundos utilizando diferentes iluminadores de LED/laser. A iluminação pulsada nessa escala de tempo permite que os fluoróforos em estado excitado tenham tempo extra para relaxar no estado fundamental e, assim, ajudar a evitar as principais vias de fotodegradação.

AI
Imagem bruta

Os dados de fluorescência de campo amplo podem ser contaminados por luz dispersa e fora de foco, mas as ferramentas baseadas em AI podem recuperar o contraste da imagem, removendo o ruído e o desfoque.

Denoise.ai
Original

O Denoise.ai pode ser aplicado para remover o componente de ruído de disparo das imagens, sem alterar a estrutura por trás da imagem e os valores de intensidade.

Utilização de inteligência artificial baseada em aprendizagem profunda para aprimorar a aquisição de imagem de células vivas

O advento dos métodos de inteligência artificial (AI) para microscopia abriu novas possibilidades para a aquisição de imagem de células vivas, utilizando dose reduzida de fótons. Métodos baseados em aprendizagem profunda estão se mostrando adequados para ensaios de aquisição de imagem de espécimes biológicos. A Nikon está comprometida em desenvolver soluções de software estáveis, baseadas em aprendizagem profunda, para diferentes aplicações – disponíveis como módulos NIS.ai para o software NIS-Elements.

Clarify.ai remove automaticamente o sinal de fluorescência fora de foco de imagens de fluorescência de campo amplo padrão. Esse módulo é pré-treinado em nossa fábrica e não requer ajuste manual do usuário na imagem final, eliminando a subjetividade no resultado. O Clarify.ai permite que o seccionamento óptico seja realizado em imagens de campo amplo de único plano, adquiridas na taxa máxima do sistema, não exigindo dados de vários planos, como na deconvolução iterativa 3D de dados de campo amplo.

Denoise.ai é outro módulo pré-treinado que remove o ruído de Poisson (ruído de disparo) de imagens confocais em tempo real. Sua utilização permite tempos reduzidos de exposição e é vantajosa quando combinada com imagens de varredura ressonante adquiridas por meio do microscópio confocal AX R, nas quais o ruído de disparo é a fonte predominante de ruído.

A Nikon também oferece o módulo Convert.ai para prever recursos de imagem que são normalmente detectados em um canal de fluorescência, sendo o sinal previsto com base em uma imagem de campo claro correspondente (por exemplo, previsão de padrões de coloração nuclear por DAPI a partir de dados de imagem DIC). Isso permite eliminar certos canais de fluorescência na aquisição de imagens, evitando a iluminação intensa exigida pelas técnicas de fluorescência. As técnicas de aquisição de imagem de campo claro são inerentemente menos fototóxicas.

O Enhance.ai pode ser treinado para prever detalhes em imagens de baixa relação sinal-ruído, melhorando efetivamente a S/R e permitindo aquisição de imagem com dose reduzida de fótons e menos fotodegradação.

Imagem de fluorescência de campo amplo de um glomérulo renal de camundongo em um corte de tecido de 16 mm de espessura antes (a) e após (b) deconvolução iterativa 3D no software NIS-Elements.

Células de levedura marcadas com Lifeact-EGFP (actina) e fotografadas utilizando o sistema de super-resolução N-SIM S.

Qual técnica de contraste é mais apropriada para sua pesquisa?

Para amostras bidimensionais relativamente planas, como células aderentes cultivadas in vitro, a aquisição de imagem de fluorescência de campo amplo pode ser suficiente. As possibilidades de emprego dessa técnica para diferentes tipos de amostra se tornam muito mais amplas ao combinar a aquisicão de imagem de campo amplo com análise de deconvolução ou focagem automática utilizando o módulo de software Clarify.ai.

A aquisição de imagem confocal torna-se necessária para amostras com mais de ~20 μm de espessura e, além disso, é útil na aquisição de imagem de alta resolução para amostras de apenas alguns μm de espessura. Os instrumentos confocais de disco giratório são rápidos e adequados para amostras de até ~50 μm (sendo o CSU-W1 capaz de obter imagens mais profundas comparado a outros modelos, já que apresenta maior espaçamento entre os pinholes). Ambos os sistemas podem ser empregados para adquirir imagens de diferentes tipos de sistemas de cultura de células 3D, como organoides e esferoides.

A aquisição de imagem confocal de varredura pontual é capaz de obter imagens mais profundas (até várias centenas de μm). O scanner ressonante apresentado pelo confocal AX R adquire imagens em taxas de vídeo mais altas e, em combinação com Denoise.ai, remove o ruído de disparo em tempo real. Ao contrário dos sistemas de disco giratório, o AX R possui um pinhole continuamente ajustável, que permite otimizar o seccionamento óptico e alcançar boa resolução utilizando qualquer lente objetiva compatível.

A imagem de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) é uma técnica de seccionamento óptico que permite a observação de características celulares que ocorrem dentro de uma fatia muito fina de uma amostra (há apenas algumas centenas de nm da interface célula-vidro). Essa técnica fornece uma melhoria na relação S/R, permitindo o uso de uma potência de laser mais baixa para proteger a saúde da célula e/ou maximizar a velocidade da aquisição de imagem. As lentes objetivas da série CFI Apochromat TIRF da Nikon também apresentam uma NA muito alta de 1,49.

As técnicas de microscopia de super-resolução são adequadas para situações em que a resolução óptica deve superar o limite de difração da luz, permitindo a visualização detalhadas de estruturas desejadas. A microscopia de super-resolução de células vivas geralmente tem sido um desafio devido às compensações exigidas para melhorar a resolução nas diferentes técnicas . O sistema de iluminação estruturada N-SIM S realiza uma modulação mais rápida do padrão de iluminação do que anteriormente, utilizando um modulador de luz espacial. O Yokogawa CSU-W1 SoRa é um sistema de super-resolução implementado no contexto de um sistema confocal de disco giratório, permitindo imagens em velocidades correspondentes ao CSU-W1 (assumindo sinal suficiente).

Embora as técnicas de aquisição de imagem de fluorescência sejam poderosas, permitindo a detecção múltipla de alvos moleculares distintos, as técnicas de aquisição de imagem de campo claro, como contraste de fase e contraste de interferência diferencial (DIC), fornecem imagens de células detalhadas com dose de fótons significativamente menor. Assim, apesar dessas técnicas não apresentarem a especificidade molecular necessária, a aquisição ocasional de imagem de campo claro é uma boa prática para ajudar a avaliar a saúde das células ao longo do experimento.

Glossário

Campo de visão
O campo de visão do sistema, também conhecido como número do campo, é o diâmetro da área da imagem em uma ampliação normal de 1X.
Limite relativo de profundidade da aquisição de imagem
Isso indica a faixa aproximada de profundidade Z (axial) dentro da qual o sistema indicado pode fornecer imagens com bom seccionamento óptico e boa relação sinal-ruído. Esse valor pode ser bastante variável e depende muito das propriedades ópticas da amostra e do recipiente, bem como da marcação.
Modalidades de aquisição de imagem suportadas
Referente às diferentes técnicas de aquisição de imagem de microscopia fornecidas por cada sistema. Observe que quase todas as modalidades de aquisição de imagem suportadas pelo microscópio invertido ECLIPSE Ti2-E podem ser acessadas quando ele é utilizado como base para qualquer um dos outros sistemas listados nesta tabela.
Suporta taxa de vídeo na aquisição de imagem
A “taxa de vídeo” é tradicionalmente definida como cerca de 30 frames por segundo (FPS). A taxa de aquisição de imagem ideal depende da aplicação exata e pode ser mais rápida ou mais lenta que 30 FPS. As câmeras EM-CCD normalmente podem criar imagens de até 60 FPS (full frame) e câmeras sCMOS de até 40-100 FPS (full frame).
Suportes de microscópios compatíveis
Referente aos modelos de suportes de microscópios da Nikon que são compatíveis com cada sistema.