Aquisição de Imagem de Células Vivas

A arte e a ciência da aquisição de imagem de células vivas

A aquisição de imagem de células vivas exige que os usuários equilibrem cuidadosamente as condições de aquisição – o objetivo é coletar os dados essenciais mínimos, reduzindo a perturbação do sistema-modelo. Embora possa ser tentador utilizar maior potência de iluminação, exposição mais longa da câmera, etc., para obter imagens com maior relação sinal-ruído (S/R), é importante entender que a fototoxicidade pode comprometer a integridade fisiológica e a viabilidade contínua do sistema. Além disso, o fotobranqueamento impõe um limite prático de quantos fótons podem ser extraídos de cada fluoróforo ao longo do experimento.

Um aspecto crucial dos experimentos de aquisição de imagem em tempo real diz respeito ao controle das condições ambientais – manutenção da mistura de gás, temperatura e umidade corretas para o sistema em questão. Isso pode ser alcançado utilizando uma inserção menor no topo da platina, para incubação, ou um sistema de gabinete maior, envolvendo a maior parte do microscópio. Tanto as inserções na parte superior da platina quanto os gabinetes maiores, projetados para microscópios Nikon, estão disponíveis nos principais fabricantes terceirizados.

Outro fator que deve ser considerado é a escolha da lente objetiva. As lentes objetivas de imersão em óleo de alta abertura numérica (NA) podem funcionar bem para recursos de aquisição de imagem próxima à lamínula, em células planas, mas sofrem de aberração esférica na aquisição de imagem mais profunda na amostra. Isso se deve ao menor índice de refração (RI) da célula/meio de cultura em comparação com o vidro/óleo. Para aplicações de aquisição de imagem mais profunda e 3D, é recomendável utilizar objetivas que empregam um meio de imersão correspondente ao RI do ambiente da amostra, como água ou silicone.

A série de objetivas CFI Apochromat Lambda S inclui várias lentes objetivas de imersão em água, incluindo a CFI Plan Apochromat IR 60XC WI, que tem a NA mais alta conhecida para uma objetiva de imersão em água (NA = 1,27). A Nikon lançou mais recentemente suas lentes objetivas da série de imersão em silicone. O silicone tem um RI de cerca de 1,4, correspondendo mais proximamente ao RI do ambiente celular, o que permite NAs mais altas do que a imersão em água. Essas objetivas são adequadas para aquisição de imagem de sistemas de cultura 3D, como organoides.

Minimizando a fototoxicidade e fotobranqueamento em células vivas

A irradiação intensa exigida pelas técnicas de aquisição de imagem baseadas em fluorescência é inerentemente prejudicial à saúde das células, especialmente os comprimentos de onda de alta energia (deslocados para o azul). Por esta razão, é recomendado o uso de fluoróforos na região do vermelho a infravermelho-próximo, embora o uso continuado de fluoróforos populares na região do verde, como EGFP, seja bastante comum e continue a funcionar bem para muitas aplicações de aquisição de imagem multicolorida.

A maioria dos microscópios utiliza o acionamento dos dispositivos do sistema através de software. No entanto, isso pode ser um pouco lento devido à relativa imprecisão do relógio do computador e às verificações e chamadas de retorno necessárias dos estados do dispositivo. Por outro lado, o acionamento por hardware utiliza o relógio altamente preciso da câmera para coordenar os dispositivos, enquanto ignora as chamadas de retorno, maximizando a velocidade do sistema e minimizando a dose de fótons. Os dispositivos acionados podem incluir platinas Z piezo, iluminadores a laser/LED e até mesmo dispositivos personalizados com capacidade de comunicação de E/S.

O acionamento também permite padrões de iluminação mais complexos. Por exemplo, é possível utilizar o software Nikon NIS-Elements para iluminar a amostra somente quando todos os pixels de uma câmera sCMOS estiverem expostos (considerando o efeito rolling shutter) – diminuindo a dose de fótons e a fotodegradação em comparação com a iluminação contínua e aquisição de imagem livre. Também é possível, durante a exposição, pulsar a iluminação em uma escala de tempo de microssegundos utilizando diferentes iluminadores de LED/laser. A iluminação pulsada nessa escala de tempo permite que os fluoróforos em estado excitado tenham tempo extra para relaxar no estado fundamental e, assim, ajudar a evitar as principais vias de fotodegradação.

Utilização de inteligência artificial baseada em aprendizagem profunda para aprimorar a aquisição de imagem de células vivas

O advento dos métodos de inteligência artificial (AI) para microscopia abriu novas possibilidades para a aquisição de imagem de células vivas, utilizando dose reduzida de fótons. Métodos baseados em aprendizagem profunda estão se mostrando adequados para ensaios de aquisição de imagem de espécimes biológicos. A Nikon está comprometida em desenvolver soluções de software estáveis, baseadas em aprendizagem profunda, para diferentes aplicações – disponíveis como módulos NIS.ai para o software NIS-Elements.

Clarify.ai remove automaticamente o sinal de fluorescência fora de foco de imagens de fluorescência de campo amplo padrão. Esse módulo é pré-treinado em nossa fábrica e não requer ajuste manual do usuário na imagem final, eliminando a subjetividade no resultado. O Clarify.ai permite que o seccionamento óptico seja realizado em imagens de campo amplo de único plano, adquiridas na taxa máxima do sistema, não exigindo dados de vários planos, como na deconvolução iterativa 3D de dados de campo amplo.

Denoise.ai é outro módulo pré-treinado que remove o ruído de Poisson (ruído de disparo) de imagens confocais em tempo real. Sua utilização permite tempos reduzidos de exposição e é vantajosa quando combinada com imagens de varredura ressonante adquiridas por meio do microscópio confocal AX R, nas quais o ruído de disparo é a fonte predominante de ruído.

A Nikon também oferece o módulo Convert.ai para prever recursos de imagem que são normalmente detectados em um canal de fluorescência, sendo o sinal previsto com base em uma imagem de campo claro correspondente (por exemplo, previsão de padrões de coloração nuclear por DAPI a partir de dados de imagem DIC). Isso permite eliminar certos canais de fluorescência na aquisição de imagens, evitando a iluminação intensa exigida pelas técnicas de fluorescência. As técnicas de aquisição de imagem de campo claro são inerentemente menos fototóxicas.

O Enhance.ai pode ser treinado para prever detalhes em imagens de baixa relação sinal-ruído, melhorando efetivamente a S/R e permitindo aquisição de imagem com dose reduzida de fótons e menos fotodegradação.

Qual técnica de contraste é mais apropriada para sua pesquisa?

Para amostras bidimensionais relativamente planas, como células aderentes cultivadas in vitro, a aquisição de imagem de fluorescência de campo amplo pode ser suficiente. As possibilidades de emprego dessa técnica para diferentes tipos de amostra se tornam muito mais amplas ao combinar a aquisicão de imagem de campo amplo com análise de deconvolução ou focagem automática utilizando o módulo de software Clarify.ai.

A aquisição de imagem confocal torna-se necessária para amostras com mais de ~20 μm de espessura e, além disso, é útil na aquisição de imagem de alta resolução para amostras de apenas alguns μm de espessura. Os instrumentos confocais de disco giratório são rápidos e adequados para amostras de até ~50 μm (sendo o CSU-W1 capaz de obter imagens mais profundas comparado a outros modelos, já que apresenta maior espaçamento entre os pinholes). Ambos os sistemas podem ser empregados para adquirir imagens de diferentes tipos de sistemas de cultura de células 3D, como organoides e esferoides.

A aquisição de imagem confocal de varredura pontual é capaz de obter imagens mais profundas (até várias centenas de μm). O scanner ressonante apresentado pelo confocal AX R adquire imagens em taxas de vídeo mais altas e, em combinação com Denoise.ai, remove o ruído de disparo em tempo real. Ao contrário dos sistemas de disco giratório, o AX R possui um pinhole continuamente ajustável, que permite otimizar o seccionamento óptico e alcançar boa resolução utilizando qualquer lente objetiva compatível.

A imagem de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) é uma técnica de seccionamento óptico que permite a observação de características celulares que ocorrem dentro de uma fatia muito fina de uma amostra (há apenas algumas centenas de nm da interface célula-vidro). Essa técnica fornece uma melhoria na relação S/R, permitindo o uso de uma potência de laser mais baixa para proteger a saúde da célula e/ou maximizar a velocidade da aquisição de imagem. As lentes objetivas da série CFI Apochromat TIRF da Nikon também apresentam uma NA muito alta de 1,49.

As técnicas de microscopia de super-resolução são adequadas para situações em que a resolução óptica deve superar o limite de difração da luz, permitindo a visualização detalhadas de estruturas desejadas. A microscopia de super-resolução de células vivas geralmente tem sido um desafio devido às compensações exigidas para melhorar a resolução nas diferentes técnicas . O sistema de iluminação estruturada N-SIM S realiza uma modulação mais rápida do padrão de iluminação do que anteriormente, utilizando um modulador de luz espacial. O Yokogawa CSU-W1 SoRa é um sistema de super-resolução implementado no contexto de um sistema confocal de disco giratório, permitindo imagens em velocidades correspondentes ao CSU-W1 (assumindo sinal suficiente).

Embora as técnicas de aquisição de imagem de fluorescência sejam poderosas, permitindo a detecção múltipla de alvos moleculares distintos, as técnicas de aquisição de imagem de campo claro, como contraste de fase e contraste de interferência diferencial (DIC), fornecem imagens de células detalhadas com dose de fótons significativamente menor. Assim, apesar dessas técnicas não apresentarem a especificidade molecular necessária, a aquisição ocasional de imagem de campo claro é uma boa prática para ajudar a avaliar a saúde das células ao longo do experimento.