Aquisição de Imagem de Tecidos e Organismos Inteiros

A aquisição profunda de imagens em organismos inteiros, órgãos e tecidos é um dos maiores desafios impostos ao microscopista de luz. Amostras biológicas são ambientes opticamente imperfeitos – dispersando tanto a luz de iluminação quanto de detecção. A dispersão e várias aberrações ópticas tornam-se progressivamente piores com o aumento da distância na amostra, impondo um limite prático na profundidade em que é possível adquirir imagens.

Produtos para Aquisição de Imagem de Tecidos e Organismos Inteiros

**Embrião de zebrafish**

20X LWD 1.0 NA WD 2,8mm Cortesia de Erika Driekorn e Dra. Beth Roman, Department of Human Genetics, Graduate School of Public Health, University of Pittsburgh.

A solução líder da Nikon para aplicações de aquisição de imagem em maior profundidade é o sistema de microscópio multifóton AX R MP. Esse sistema suporta comprimentos de onda de excitação de até 1300 nm, permitindo imagens de até 1,4 mm na amostra. Também é possível digitalizar simultaneamente utilizando dois feixes, o que acelera a aquisição de imagens multifótons multicoloridas.

Para a aquisição de imagem em profundidades de até algumas centenas de micrômetros (µm), a Nikon oferece o sistema de microscópio confocal AX / AX R. A detecção confocal utilizando um único pinhole, como no AX / AX R, evita a luz fora de foco e permite melhor seccionamento óptico quando comparada a instrumentos confocais que utilizam uma matriz de pinholes.

O sistema confocal de disco giratório Yokogawa CSU-W1, comparado à maioria dos instrumentos de disco giratório, é otimizado para aquisição de imagem de espécimes maiores, apresentando um espaçamento mais amplo entre os pinholes no disco giratório, o que reduz a diafonia entre pinholes – um recurso útil para aplicações de aquisição de imagem em maior profundidade.

●: Incluído, ⚬: Opcional

Suportes de microscópios compatíveis	AX R MP	AX / AX R	CSU-W1
	AX R MP Sistema de Microscópio Multifóton	AX / AX R Sistema de Microscópio Confocal	CSU-W1 Scanner confocal de disco giratório
Campo de visão	22 mm diagonal (quadrado)	25 mm diagonal (quadrado)	17 x 16 mm (retangular)
Limite relativo de profundidade da aquisição de imagem	~ 1,4 mm (com excitação de 1300 nm)	~ 100 – 500 μm	~ 50 – 100 μm
Suporta taxa de vídeo na aquisição de imagem	Sim (30 FPS com varredura de 512 x 512)	Sim (30 FPS com varredura de 512 x 512)	Sim (limitado pelo sistema da câmera e velocidade de rotação do disco)
Opções de detector	Detectores GaAsP non-descanned (NDDs), até 4 canais.	Detectores de tubo fotomultiplicador (PMT) GaAsP ou Multi-alkali disponíveis, até 4 canais.	Câmeras monocromáticas sCMOS ou EM-CCD recomendadas. Opções de multicâmera e divisor de câmera disponíveis.
ECLIPSE Ti2-E Invertido	yes	yes	yes
ECLIPSE Ti2-A Invertido	no	no	yes
ECLIPSE Ti2-U Invertido	no	no	yes
ECLIPSE Ni-E Vertical	no	yes	yes
ECLIPSE Ni-U Vertical	no	no	yes
FN1 Vertical	no	yes	yes
AX-FNGP Vertical	yes	no	no
AX-FNSP Vertical	yes	no	no

Discussão de Aquisição de Imagem de Tecidos e Organismos Inteiros

Clarificação do tecido

Circuito auditivo do tronco cerebral de pintinho clarificado com protocolo CUBIC. (E17)
Corante: Tetbow (Tetracycline transactivator Brainbow)
CFI Plan Apochromat 10XC Glyc
Dr. Ryo Egawa, Dr. Hiroshi Kuba, Cell Physiology Graduate School of Medicine Nagoya University

Clareamento de tecidos e lentes objetivas compatíveis

O desenvolvimento de métodos de clareamento óptico para aumentar a transparência de tecidos biológicos permitiu uma melhora na observação de amostras maiores e mais complexas. Da mesma forma, os métodos de preparação de amostras para microscopia de super-resolução de expansão aumentam fisicamente o tamanho da amostra, geralmente por um fator de ~ 4 a 10 vezes ou mais e, portanto, também exigem instrumentos adequados para a aquisição de imagens mais profunda.

Ao observar amostras espessas por meio de um microscópio, é de extrema importância minimizar a diferença entre o índice de refração da amostra e o índice de refração do meio de imersão, reduzindo, assim, a aberração esférica, que limita a qualidade da imagem e a distância útil de trabalho. A Nikon oferece lentes objetivas para aquisição de imagem de espécimes clarificadas, que podem ser imersas diretamente em uma variedade de meios de clarificação e incluem colar de correção para índice de refração (RI). Essas objetivas também apresentam longas distâncias de trabalho, altas aberturas numéricas e muito mais.

A Nikon também produz as lentes objetivas da série de imersão em silicone, série de imersão em água CFI75 e série Lambda S (a última categoria inclui várias lentes de imersão em água). As lentes que utilizam imersão em silicone, água e glicerina são geralmente mais fáceis de combinar com meios de clarificação e meios de montagem comuns, que geralmente têm um RI menor que o óleo, mas maior que o ar.

Aquisição de imagens *in vivo* de um camundongo YFP-H anestesiado (4 semanas de idade), obtidas através do método de abertura do crânio. Visualização de todos os neurônios piramidais da camada V e dos neurônios mais profundos do hipocampo. Aquisição de imagem tridimensional de dendritos do hipocampo até 1,4 mm no cérebro.
Capturada com GaAsP NDD episcópico para 1300 nm e lente objetiva CFI75 Apochromat 25XC W 1300 (NA 1,10, WD 2,0 mm), Comprimento de onda de excitação: 1040 nm
Fotografada com a colaboração de: Drs. Ryosuke Kawakami, Terumasa Hibi e Tomomi Nemoto, Research Institute for Electronic Science, Hokkaido University

Estratégias de iluminação para aquisição de imagens em maior profundidade

Existem estratégias além da filtragem espacial da luz, como em um microscópio confocal, que visam melhorar a capacidade de aquisição de imagens em maior profundidade na amostra. Uma abordagem, que pode ser implementada em qualquer microscópio de fluorescência, é a utilização de sondas com espectros de emissão e excitação mais deslocados para o vermelho. A luz de comprimento de onda mais longo é menos dispersa e, portanto, adequada para aquisição mais profunda de imagens. A aquisição de imagem no espectro do vermelho-distante e infravermelho-próximo (NIR) é possível nas séries de instrumentos confocais AX / AX R e CSU-W1.

Os benefícios do uso de iluminação de comprimento de onda mais longo são aumentados quando combinados com excitação multifóton – processo pelo qual um fluoróforo, que geralmente é excitado por um fóton de uma determinada energia/comprimento de onda, pode ser excitado por dois ou mais fótons de comprimentos de onda mais longos, com energia total semelhante. Esse processo é quase inexistente na natureza, pois a probabilidade de vários fótons com a energia correta serem absorvidos por um fluoróforo quase no mesmo instante é extremamente baixa.

Na prática, alcançar a excitação multifóton requer um laser pulsado de alta potência de femtossegundos – e mesmo assim a densidade de potência só é alta o suficiente para excitar a fluorescência no foco do feixe. Isso essencialmente elimina a excitação de fluorescência fora de foco e evita, de certa forma, a necessidade de abertura do pinhole para filtrar a emissão fora de foco. Embora a abertura do pinhole ainda possa ser utilizada para ajudar a melhorar o seccionamento óptico, geralmente é desejável maximizar o sinal detectado, visto que a dispersão e outros problemas permanecem.

Glossário

Campo de visão: O campo de visão do sistema, também conhecido como número do campo, é o diâmetro da área da imagem em uma ampliação normal de 1X.
Limite relativo de profundidade da aquisição de imagem: Isso indica a faixa aproximada de profundidade Z (axial) dentro da qual o sistema indicado pode fornecer imagens com bom seccionamento óptico e boa relação sinal-ruído. Esse valor pode ser bastante variável e depende muito das propriedades ópticas da amostra e do recipiente, bem como da marcação.
Opções de detector: Os sistemas confocais e multifótons de varredura pontual geralmente utilizam detectores de elemento único, como tubos fotomultiplicadores (PMTs), enquanto instrumentos confocais de disco giratório e sistemas de campo amplo utilizam câmeras digitais.
Suporta taxa de vídeo na aquisição de imagem: A “taxa de vídeo” é tradicionalmente definida como cerca de 30 frames por segundo (FPS). A taxa de aquisição de imagem ideal depende da aplicação exata e pode ser mais rápida ou mais lenta que 30 FPS. As câmeras EM-CCD normalmente podem criar imagens de até 60 FPS (full frame) e câmeras sCMOS de até 40-100 FPS (full frame).
Suportes de microscópios compatíveis: Referente aos modelos de suportes de microscópios da Nikon que são compatíveis com cada sistema.