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Pendant des centaines d'années, la microscopie optique a été reléguée au régime limité par la diffraction, incapable de résoudre les détails inférieurs à environ 200 nm (en XY) et à 500 nm (en Z). Cette limite a été brisée, entraînant un certain nombre de techniques et aboutissant au prix Nobel de chimie 2014 décerné à des pionniers de la microscopie à super-résolution. Nous pouvons maintenant imaginer la résolution précédente deux fois supérieure grâce à la microscopie à illumination structurée (SIM) et une résolution environ 10 fois supérieure avec la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM). La résolution améliorée est même extraite d'instruments confocaux en utilisant des valeurs de trou d'épingle et de déconvolution sous l'unité Airy. Nikon est fier de mettre sur le marché un certain nombre de technologies de super-résolution et s’attache à surmonter les nombreux défis uniques de son adoption réussie dans des systèmes expérimentaux difficiles.
La microscopie à illumination structurée de haute résolution (SIM) est une technique d'imagerie révolutionnaire permettant de doubler la résolution d'un microscope à champ large en 3D. L'éclairage structuré est réalisé avec une interférence de faisceau au niveau du plan d'échantillonnage, produisant un motif de diffraction limité et sinusoïdal de bandes claires-foncées. La fréquence spatiale unique présente dans le motif se mélange aux différentes fréquences spatiales constituant la structure de l'échantillon. En bref, les fréquences spatiales généralement en dehors de la bande passante du microscope peuvent être artificiellement modulées via un mélange de fréquences, permettant leur détection indirecte et leur restauration ultérieure en post-traitement. La carte SIM peut améliorer jusqu'à 2 fois la résolution optique d'un microscope à champ large typique en x, y et z.
La microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et des techniques similaires exploitent le concept de la localisation d'une molécule unique pour améliorer la résolution optique d'environ un facteur 10 par rapport à l'imagerie à champ large. Diverses techniques photochimiques existent pour "désactiver" la plupart des fluorophores marquant un échantillon donné. En "allumant" un petit nombre de fluorophores à la fois, les événements à émission unique peuvent être facilement identifiés, et leur position centrale est ajustée statistiquement à un voxel limité en sous-diffraction. Les utilisateurs peuvent s'attendre à une résolution d'environ 20 nm en XY et à 70 nm en Z. Notez que STORM est mis en œuvre conjointement avec des préparations d'échantillons et des systèmes tampons spécialisés pour induire une permutation .
Bien que l,on sache depuis longtemps que l'analyse par déconvolution peut être utilisée pour améliorer la résolution signal-bruit et la résolution optique des données de microscopie confocale, ce n'est que récemment que cela est devenu pratique de le faire régulièrement. Il y a des années, la déconvolution d'ensembles de données, même modestes, nécessitait un traitement de nuit, empêchant une utilisation généralisée par des non-spécialistes. Les ordinateurs modernes, les algorithmes améliorés et l'accélération GPU ont considérablement réduit le temps nécessaire à la déconvolution, ce qui en fait un ajout simple à presque tous les flux de production d'images. Le module logiciel de résolution améliorée (ER) de Nikon fournit des algorithmes de déconvolution conçus pour les données confocales à balayage ponctuel et utilise des modèles de fonction de dispersion de points (PSF) spécialisés pour les objectifs de la série CFI de Nikon. Cliquez pour télécharger notre E-Book sur la microscopie confocale et de super-résolution et en apprendre davantage!
L'aberration sphérique est l'une des aberrations optiques les plus courantes limitant les performances des microscopies de haute résolution. De nombreux objectifs comprennent un collier de correction pour corriger les aberrations sphériques causées par les variations d'épaisseur du verre de couverture et l'indice de réfraction du milieu de l'échantillon. Cependant, le réglage du collier de correction peut être fastidieux à effectuer (en particulier pour les échantillons multiples) et la position optimale est difficile à identifier en toute confiance. La série d'objectifs de correction automatique (ACC) de Nikon pour la microscopie de super-résolution assure le plus haut degré de correction d'aberration sphérique pour votre échantillon en combinaison avec une routine de réglage automatique dans le logiciel
NIS-Elements. Les objectifs ACC peuvent être utilisés pour optimiser les performances de résolution de tout système, avec des versions disponibles pour nos huiles 100 x HP Apo TIRF, 100 x SR Apo TIRF et 60 x SR Plan Apo.
Tirer pleinement profit de la super-résolution n'est pas possible sans assurer la stabilité maximale du système. Un faible degré de dérive focale, normalement imperceptible avec les techniques traditionnelles, pourrait suffire à compromettre la collecte de données de super-résolution. La plate-forme de microscope de recherche inversée Ti2-E comprend un tout nouveau mécanisme de mise au point Z basé sur une came qui élimine la dérive XY pour fournir une plate-forme ultra-stable pour les applications exigeantes. Le Ti2-E intègre également la dernière génération de système de mise au point parfaite (PFS4) de Nikon, la technologie de pointe de verrouillage de mise au point. En utilisant un encodeur linéaire et un mécanisme de retour rapide, le PFS4 corrige les dérives de mise au point causées par les changements de température et les vibrations mécaniques. La nouvelle conception modulaire de PFS4 sépare la partie de détecteur de la tourelle pour réduire la charge sur l'entraînement en Z et la production de chaleur a été pratiquement éliminée pour fournir un environnement d'imagerie incroyablement stable.