完整生物体和组织成像

完整生物体、器官和组织中的深度成像是光学显微镜工作者面临的最大挑战之一。生物样品是光学上不完美的环境 - 散射照明光和检测光:随着进入样品的深度逐步增加,散射和各种光学像差逐渐恶化,最终对可能的成像深度产生实际限制。

完整生物体和组织成像产品

斑马鱼胚
20X LWD 1.0 NA WD 2.8mm
图像授权:匹兹堡大学公共卫生研究生院人类遗传学系Erika Driekorn和Beth Roman博士

AX R MP 多光子共聚焦显微镜是尼康面向深度成像应用的领先解决方案。该系统支持高达1300 nm的激发波长,样本中的成像深度可达1.4 mm。其还可同时用两束光扫描,加快了多色多光子图像的采集速度。

对于几百微米(µm)深度上的成像,尼康推出了AX / AX R共聚焦显微镜系统。与使用针孔阵列的共聚焦仪器相比,单针孔共聚焦探测和使用AX / AX R一样,允许更大的焦外光抑制和光学切片。

横河电机CSU-W1转盘式共聚焦系统针对更大标本(与大多数转盘式仪器的成像标本相比)的成像进行了优化,在转盘中使用更宽的针孔间距以减少针孔串扰——这是深度成像应用的一个有用功能。

●: 包含, ⚬: 选配

AX R MP多光子共聚焦显微镜 AX / AX R共聚焦显微镜系统 横河电机CSU-W1转盘式共聚焦系统
视野 22 mm对角线(正方形) 25 mm对角线(正方形) 17×16 mm(长方形)
相对成像深度限制 ~ 1.4 mm(激发波长1300 nm) ~ 100 – 500 μm ~ 50 – 100 μm
支持视频速率成像 支持(512×16下扫描时成像速率为720 FPS) 支持(512×512下扫描时成像速率为30 FPS;仅限AX R) 支持(受相机系统和转盘转速限制)
探测器选件 GaAsP非退扫描探测器(NDD;落射和透射均可提供)。最多4通道。 可提供GaAsP和多碱光电倍增管(PMT)探测器。最多4通道。 建议采用单色sCMOS或EM-CCD相机。可提供多相机和相机分配器选件。
兼容的显微镜机身 AX R MP AX / AX R CSU-W1
ECLIPSE Ti2-E 倒置显微镜 yes yes yes
ECLIPSE Ti2-A 倒置显微镜 no no yes
ECLIPSE Ti2-U 倒置显微镜 no no yes
ECLIPSE Ni-E 正置显微镜 no yes yes
ECLIPSE Ni-U 正置显微镜 no no yes
FN1正置显微镜 no yes yes
用于多光子共聚焦系统的AX-FNGP显微镜 yes no no
用于多光子共聚焦系统的AX-FNSP 显微镜 yes no no

关于完整生物体和组织成像

组织透明化

用CUBIC方案透明化的小鸡听觉脑干回路(E17)
染料:Tetbow(四环素反式激活蛋白脑虹)
CFI Plan Apochromat 10XC Glyc
名古屋大学细胞生理学医学研究生院的Ryo Egawa博士、Hiroshi Kuba博士

组织透明化和兼容物镜

面向提高生物组织透明度的光透明方法的最新发展已允许更好地观察更大和更复杂的样本。超分辨率膨胀显微样本制备方法相应地物理增大了样本尺寸,通常增加4-10倍左右或更大,因此也需要适合深度成像的仪器。

使用显微镜观察厚样本时,最重要的是尽量减小样本折射率与浸没介质折射率之间的差异,从而更好地减小限制成像质量和可用工作距离的球面像差。尼康提供的透明化标本成像专用物镜不仅可直接浸没在各种透明剂中,还配备有折射率(RI)校正环。此类物镜还具有工作距离长、数值孔径高等特点。

尼康还生产Silicone Immersion系列、CFI75水浸系列Lambda S物镜系列物镜(最新产品目录包括几种水浸物镜)。采用硅酮、水和甘油浸没介质的物镜通常更易与常用透明剂和封片剂(其折射率一般比油小,比空气大)配合使用。

通过开颅方法实现麻醉YFP-H小鼠(4周大)的体内成像。对整层V锥体神经元和海马深层神经元进行可视化。为深至大脑1.4 mm的海马树突三维成像而实现的深度成像。
用1300 nm反射GaAsP NDD和CFI75 Apochromat 25XC W 1300物镜(数值孔径1.10,工作距离2.0 mm)捕获,激发波长:1040 nm
拍摄合作伙伴:北海道大学电子科学研究所的Ryosuke Kawakami博士、Terumasa Hibi博士和Tomomi Nemoto博士

深度成像的照明策略

和使用共聚焦显微镜一样,也存在除空间滤光之外的深度成像性能改进策略。一种可在任何荧光显微镜上实现的方法是使用具有更多红移激发和发射光谱的探针。光的波长越长,散射越少,因此越适合深度成像。AX / AX R和CSU-W1系列共聚焦仪器上均可实现远红外和近红外(NIR)光谱成像。

当与多光子激发(通常用一个具有指定能量/波长的光子激发的荧光团借此过程可用两个或多个总能量相似的更长波长的光子激发代替)结合时,使用较长波长照明具有多方面好处。自然界中这一过程几乎是不存在的,因为多个具有适当能量的光子被一个荧光团同时吸收的概率极低。

事实上,实现多光子激发需要功率极高的飞秒脉冲激光器,甚至还要求功率密度仅高到足以在激光束焦点上激发荧光。这基本上消除了焦外荧光激发,排除了通过针孔排除焦外背景光的需要。虽然仍然可以使用针孔孔径来帮助改善光学切片,但因散射和其他问题仍然存在,通常需要最大化检测到信号。

词汇表

兼容的显微镜机身
指与每个系统兼容的尼康显微镜机身型号
探测器选件
点扫描多光子和共聚焦系统一般采用单像素探测器,如光电倍增管(PMT),而转盘式共聚焦和宽场成像仪器则采用数码相机。
支持视频速率成像
“视频速率”的传统定义是30帧/秒(FPS)左右。当然最佳成像速率取决于具体应用,可能比30 FPS快也可能比30 FPS慢。EM-CCD相机的典型成像速率可达到60 FPS(全幅),sCMOS相机则可达到40-100 FPS(全幅)。
相对成像深度限制
表示指定系统在保证图像的光学切片质量和信噪比的前提下,成像的近似Z(轴)深度范围。该值可能相差很大,且与标本和容器以及荧光标记情况密切相关。
视野
系统的视野(也称视场数)即为标称1X放大倍率下成像区域的直径。