电生理学

电生理学是研究生物标本电学特性的学科。该术语也可指临床中经典的组织/器官水平的电学记录方法(如心电图)以及将在此讨论的实验室中配合光学显微镜进行的典型细胞/亚细胞水平的记录方法。膜片钳记录法一贯是是单一神经细胞或肌肉细胞(或单离子通道)中记录电学活性的标准方法,可在各种模型系统内进行记录,包括体外细胞培养、离体组织和体内试验等。

膜片钳记录法需要使用微米级玻璃电极(利用显微操纵系统定位)吸住“一片”细胞膜。通过玻璃电极内的细银丝实现电学记录。全细胞膜片钳和膜穿孔方法可向细胞内注入各类实验试剂,如使用荧光染料(例如电压、钙的指示剂),既可用于显微镜观察。

电生理学产品

ECLIPSE FN1正置显微镜是尼康面向电生理学应用的核心显微镜解决方案。其纤巧的“I”字形机架设计可方便操作样品,为显微操纵器和其他设备的摆放提供了空间。独特的前/后双位滑动式物镜转换器,可在物镜切换时,可将物镜提升15 mm,以避免干扰样本和显微操纵设备。

FN1兼容一系列面向深层成像的共聚焦解决方案。横河电机生产的CSU系列转盘式共聚焦显微镜可在活细胞和组织切片中完成快速光切成像。尼康AX / AX R点扫描共聚焦显微镜,成像相较于转盘式共聚焦更深。AX R具备共振扫描单元,最高成像速率达720帧/秒(FPS;2048 ×16带状扫描模式),可完成对钙动态及其类似快速动态事件进行成像。

●: 包含, ⚬: 选配

ECLIPSE FN1正置显微镜
(仅限宽场)
CSU-X1转盘式共聚焦系统的* CSU-W1转盘式共聚焦系统的* AX/AX R共聚焦系统的*
视野 25 mm对角线(宽场;圆形) 10×7 mm(共聚焦;长方形) 17×16 mm(共聚焦;长方形) 25 mm对角线(宽场;正方形)
变倍倍率 0.35X、2.0X、4X(宽场;使用FN-DP双端口&变倍器)
1.0X、1.25X、1.5X、2.0X(宽场;使用FN-MT变倍器转盘)
1 – 1000X(共聚焦;连续可变扫描变倍)
相对成像深度限制 ~ 5 μm
~ 15 – 25 μm
(配合反卷积)
~ 50 μm ~ 50 – 100 μm ~ 100 – 500 μm
兼容成像方式 ECLIPSE FN1 CSU-X1* CSU-W1* AX / AX R*
明场 yes no no no
点扫描共聚焦 no no no yes
转盘式共聚焦 no yes yes no
微分干涉相差(DIC) yes no no no
红外DIC(IR-DIC) yes no no no
倾斜照明 yes no no no
宽场落射荧光 yes no no no
宽场落射荧光 yes no no no

*兼容与该表中的共聚焦及多光子系统的显微技术取决于系统所连接的显微镜镜座。例如,在ECLIPSE FN1显微镜上配置AX/AX R共聚焦系统时,可使用可通过FN1执行的显微技术。

关于电生理学

使用FN1正置显微镜获得离体脑组织中膜片钳记录神经元的IR-DIC图像。

电生理学实验中使用的成像方式

虽然电生理学实验中对样本进行荧光标记十分常见,但膜片钳记录却无需如此。样本的可视化一般采用无标记成像技术完成。由于样本往往很厚(例如大脑切片的厚度为数百微米),光线散射会限制深层观察的细节,进而为无标记成像技术带来挑战。

明场和相差等无标记成像方法虽可适宜较薄的样本(如贴壁培养细胞),但并不适合厚组织切片及在体成像,因此可选择具有光切能力的微分干涉相差(DIC),在维持高分辨率的同时实现更深层的成像(DIC利用了物镜的完整数值孔径)。

遗憾的是,单靠DIC往往是不够的,因此尼康提供了近红外DIC(IR-DIC)技术,其使用了近红外(NIR)照明及相关光学组件。近红外光凭借比可见光更长的波长,能够更深地穿透到样本中,从而分辨出可见光DIC因深度受限而无法识别的单个神经元。

电生理学验专用物镜

显微镜通常配置电生理学实验专用的水浸物镜,其中物镜的尖端直接浸没在样本溶液中(不带盖玻片)。电生理学专用水浸物镜的尖端一般采用化学惰性和电绝缘材质(如陶瓷)制成。物镜的外形也很重要,其尖端应具有较大的接近角(朝向尖端),以便为显微操纵器提供更大的操作空间。

尼康CFI60水浸系列物镜具有更高水平的像差校正和NIR透过率,使其成为电生理学研究的理想选择,尤其是在与IR-DIC或多光子成像配合使用时。所有CFI60水浸物镜均可与IR-DIC兼容,而使用NIR 40X W和NIR 60X W物镜时,还可从其增强的NIR透过率中额外受益。CFI Plan 100XC W还配有校正球差的校正环。

尼康CFI75水浸系列物镜包括16X和25X水浸物镜。为了容纳更大的光学组件以足够宽的角度收集光线进而达到更高的数值孔径(NA)和更长的工作距离,该系列物镜的外形比CFI60系列更大,螺纹尺寸为M32,齐焦距离为75 mm。CFI75 LWD 16X W是“单物镜方案”的流行选择,使用FN-DP双端口&变倍器,可具备5.6X、32X和64X的放大倍率。CFI75 Apochromat 25XC W 1300是尼康制造的最亮物镜之一,透过率高,且可实现1300 nm波长的像差校正。所有CFI75水浸物镜均可兼容IR-DIC。

面向电生理学和光遗传学的显微镜配置

针对各种功能,通过光遗传学刺激表达了光敏感蛋白的细胞,如光学门控离子通道Channelrhodopsin-2(ChR2),是多种实验应用的一种流行方法。神经细胞和肌肉细胞的光遗传学刺激配合膜片钳记录读出信号。利用该方法可直接评价不同神经元的局部及远距离功能联系。光遗传学刺激一般使用图形化照明方式的专用光刺激器件。

FN1显微镜可配置手动调节的单点光刺激设备或数字微镜器件(DMD)。DMD允许应用具有近衍射极限结构的任意照明形状,可实现精确的细胞到亚细胞目标刺激、并使用用户可编程照明模式及高达4000 Hz的频率刺激。

词汇表

兼容成像方式
一般来说,电生理显微镜系统至少具备一种透射照明技术来进行无标记成像(如IR-DIC红外微分干涉)。不同的实验可能还需要荧光成像模式(宽场、共聚焦或多光子)。
变倍倍率
和FN1显微镜一样,宽场显微镜的变倍倍率通常是通过光学方式实现的,例如使用变倍镜附件提供一组预设数量的倍率选择。点扫描共聚焦和多光子系统通常依靠扫描变倍,通过保持高分辨率成像的同时扫描较小的区域进而模拟实现光学变倍。
相对成像深度限制
表示指定系统能够在一定的Z(轴)深度范围内获取足够的光学切片质量及信噪比的图像。该深度可能相差很大,且与标本/,容器以及光学标记的特性密切相关。
视野
系统的视野(也称视场数)即为标称1X放大倍率下成像区域的直径。