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数百年来,光学显微镜被衍射极限所桎梏,无法分辨小于约200nm(XY)和500nm(Z)的细节。大量更新的新技术,已将这一限制打破,并最终将2014年诺贝尔化学奖授予了超分辨率显微镜领域的先驱者们。我们现在可以使用结构化照明显微镜(SIM)以两倍的分辨率成像,并使用随机光学重建显微镜(STORM)获得大约10倍的分辨率。通过使用亚艾里单元针孔和反卷积,甚至可以从共聚焦系统中提取增强的分辨率图像。尼康很自豪能够将多种不同的超分辨率技术推向市场,可在复杂的实验系统中成功应用并致力于克服众多独特的挑战。
超分辨率结构化照明显微术(SIM)是一种革命性的成像技术,可将3D宽场显微镜的分辨率提高一倍。在样品平面处利用光束干涉进行结构化照明,产生衍射极限和正弦图案相干的明暗条纹。图案中存在的单个空间频率与包括样本结构的各种空间频率混合。简而言之,通常在显微镜带通之外的空间频率可以通过频率混合进行人工下调,从而允许它们在后处理中进行间接检测和随后的恢复。与x,y和z中的典型宽场显微镜的光学分辨率相比,SIM可以提供高达2倍的改进。
与宽视场成像相比,随机光学重建显微镜(STORM)和类似技术利用单分子定位的概念将光学分辨率提高约10倍。用多种光化学技术实现“关闭”标记样品的大多数荧光团。通过一次“接通”少量荧光团,可以容易地识别单个发射事件,并且它们的中心位置在统计上适合于子衍射受限体素。用户可能期望XY的分辨率约为20 nm,Z的分辨率约为70 nm。请注意,STORM需要专门的样品标记和成像缓冲系统, 才能实现单分子定位。
虽然人们早就知道反卷积分析可用于改善共聚焦显微镜数据的信噪比和光学分辨率,但直到最近才开始常规地这样做。多年前,即使是很小数据量的反卷积也需要处理一夜,这使得非专业人员无法广泛使用。现代计算机,改进的算法和GPU加速大大减少了执行反卷积所需的时间,使其成为几乎所有成像工作流程的简单添加。尼康的增强分辨率(ER)软件模块提供了针对点扫描共焦数据设计的反卷积算法,并使用针对尼康CFI系列物镜专用的点扩散函数(PSF)模型。
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球差是最常见的光学像差之一,限制了高分辨力显微镜的性能。许多物镜包括校正环以校正由盖玻璃厚度的变化和样品介质的折射率引起的球差。然而,校正环调整可能很繁琐(特别是对于多个样本)并且难以识别最佳位置。尼康的自动校正环(ACC)系列超分辨率显微镜物镜可确保您的样品具有最高程度的球差校正,并结合 NIS-Elements 软件中的自动调整程序。ACC物镜可用于最大化任何系统的分辨率性能,其版本可用于我们的100x HP Apo TIRF Oil、100x SR Apo TIRF Oil、和60x SR Plan Apo水浸物镜。
如果不确保最大的系统稳定性,就无法实现超分辨率的全部优势。通常用传统技术无法察觉的微小焦点漂移可能足以损害超分辨率数据收集。Ti2-E 倒置研究级显微镜平台采用全新的基于凸轮连杆的Z轴调焦机制,可消除XY漂移,为要求苛刻的应用提供超稳定平台。Ti2-E还采用了尼康最新一代的完美对焦系统(PFS4),这是业界领先的锁焦技术。利用线性编码器和高速反馈机制,PFS4可校正由温度变化和机械振动引起的焦点漂移。PFS4的新模块化设计将探测器部分与物镜转盘分开,以减轻z轴驱动器的负担,并且几乎消除了热量输出,从而提供了令人难以置信的稳定成像环境。