Imagerie à l'échelle nanométrique

Pendant des centaines d’années, la résolution de la microscopie optique a été fondamentalement limitée par la diffraction, ~ 200 nanomètres (nm) étant considérés comme la limite approximative en XY. Cela peut être suffisant pour observer des cellules individuelles et de nombreuses caractéristiques sous-cellulaires, mais cela est insuffisant pour résoudre les détails fins de l’échelle des sous-organites et les biomolécules uniques, qui ont souvent des dimensions dans le nm unique.

L’histoire récente a vu l’invention de nombreuses méthodes d’imagerie optique « super-résolution », exploitant différentes stratégies pour contourner la limite imposée par la diffraction. L’importance de la super-résolution a été reconnue par le prix Nobel de chimie 2014 et a déjà contribué à plusieurs découvertes, telles que la structure de l’échafaudage périodique axonal.

Produits pour l’imagerie à l’échelle nanométrique

Image 3D-STORM d’une culture neuronale avec de l’actine marquée en fluorescence (code couleur pour la profondeur), acquise à l’aide d’un système Nikon N-STORM par le Pr Christophe Leterrier (CR1 CNRS).

Le système de microscope à super-résolution Nikon N-STORM offre la résolution la plus élevée des systèmes proposés par Nikon, environ un ordre de grandeur supérieur à celui de l’épifluorescence à champ large en XYZ. Le N-STORM est configuré sur le microscope inversé Ti2-E, qui offre une grande stabilité grâce au système de verrouillage de la mise au point Perfect Focus System 4 (PFS4), qui est également utilisé pour une translation axiale fine pour notre mode d’imagerie d’empilement en Z STORM, permettant d’imager des volumes jusqu’à ~ 5 µm d’épaisseur. L’imagerie par fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) conventionnelle est également possible avec le N-STORM.

Le système de microscope à super-résolution N-SIM S utilise un modulateur spatial de lumière pour réaliser une permutation rapide des modèles d’interférence, offrant une accélération de la vitesse pour les modes 9 images (2D-SIM, TIRF-SIM) et 15 images (3D-SIM ). La SIM à 9 images peut être réalisée à des vitesses allant jusqu’à 15 images par seconde (FPS) - compatible avec de nombreuses applications d’imagerie de cellules vivantes. TIRF-SIM fournit une augmentation supplémentaire de la résolution en (XY), ainsi que la section optique de la microscopie TIRF. Le système de microscope à super résolution N-SIM E est un modèle SIM plus rentable pour l’imagerie 3D-SIM et offre la même amélioration de résolution que le N-SIM S.

Le système confocal à disque rotatif à super-résolution SoRa Yokogawa CSU-W1 est un instrument confocal à disque rotatif qui intègre un disque à microlentilles d’émission pour réaliser une super-résolution par réaffectation optique des pixels. Étant donné que le SoRa CSU-W1 utilise une conception de disque rotatif, l’acquisition d’images est rapide.

●: Inclus, ⚬: Optionnel

Supports de microscope compatibles	N-STORM	N-SIM S	N-SIM E	CSU-W1 SoRa
	N-STORM Système de microscope à super résolution	N-SIM S Système de microscope à super résolution	N-SIM E Système de microscope à super résolution	Yokogawa CSU-W1 SoRa Système de super-résolution à disque rotatif
Limite de résolution optique relative	~20 nm (XY)* ~50 nm (Z)*	~115 nm (XY)* ~86 nm (XY ; mode FRBR-SIM* ~269 nm (Z; mode 3D-SIM)*	~115 nm (XY)* ~269 nm (Z; mode 3D-SIM)*	~120 nm (XY)*
Limite de profondeur d'imagerie relative	~ 5 μm	~ 10 – 20 μm	~ 10 – 20 μm	~ 50 – 100 μm
Taux d’acquisition d’images pris en charge	~0.1 FPS (jusqu’à 500 Hz d’acquisition d’images uniques)	~15 FPS (2D-SIM et TIRF-SIM uniquement)	~1 FPS (tous les modes)	~30+ FPS (limité uniquement par le rapport signal/bruit, la vitesse de rotation du disque et le taux de lecture de la caméra)
Canaux spectraux pris en charge	3	6	3	6
Zone d’acquisition d’images maximale	80 x 80 μm (avec objectif 100X)	66 x 66 μm (avec objectif 100X)	66 x 66 μm (avec objectif 100X)	61 x 57 μm (en utilisant un objectif 100X avec une lentille de grossissement 2,8X)
Inversé ECLIPSE Ti2-E	yes	yes	yes	yes
Inversé ECLIPSE Ti2-A	no	no	no	yes
Inversé ECLIPSE Ti2-U	no	no	no	yes

*Ces valeurs sont fournies à titre indicatif. Les performances de résolution varient en fonction des conditions exactes. Les estimations de résolution ne sont pas fournies pour les dimensions où aucune amélioration n’est attendue.

Discussion sur l’imagerie à l’échelle nanométrique

Analyse quantitative de la colonne vertébrale avec empilement en Z de 3D-SIM, 35 étapes, plage Z : 4,2 umTemps d’exposition 100 ms, intervalles de 120 secondes
Intervalle de temps de 11 fois
Longueur d’onde d’excitation 488 nm

Informations sur l’échantillon : épine dendritique dans un neurone hippocampique de souris exprimant la GFP
Film gracieusement offert par : Drs. Yutaro Kashiwagi et Shigeo Okabe, Département de neurobiologie cellulaire, École supérieure de médecine et Faculté de médecine, Université de Tokyo.

Trouver la méthode de super-résolution qui vous convient

Les techniques d’imagerie à super-résolution améliorent la résolution au-delà de la limite de diffraction, mais chaque technique a également ses propres limites et compromis qui doivent être bien compris afin de déterminer celle qui convient le mieux à votre recherche.

Tout d’abord, les taux d’acquisition en super-résolution sont généralement plus lents que les techniques traditionnelles. L’imagerie avec N-STORM est difficile à appliquer dans les cellules vivantes en raison du taux d’acquisition plus lent (nécessitant presque universellement plus d’une seconde par image). STORM et d’autres techniques SMLM offrent la plus grande amélioration de la résolution, mais elles sont compatibles avec un nombre limité de fluorophores, dont beaucoup nécessitent des systèmes de tampons spécialisés qui ne sont pas compatibles avec les cellules vivantes.

Le N-SIM S et Yokogawa CSU-W1-SoRa sont mieux adaptés à l’imagerie de cellules vivantes à super-résolution car ils prennent en charge des taux d’imagerie plus rapides (15 FPS pour N-SIM S, plus élevés pour CSU-W1-SoRa) et peuvent être utilisés avec fluorophores conventionnels sans système tampon spécifique.

Objectif à collier de correction automatique Nikon montée sur un microscope inversé Ti2-E.

Objectifs de haute performance pour une super-résolution

L’un des facteurs les plus critiques en ce qui concerne l’optimisation de la résolution optique est le choix de l’objectif. Ceci s’applique aussi bien à la super-résolution qu’aux autres techniques d’imagerie.

L’ouverture numérique (NA) de l’objectif doit être aussi élevée que possible tout en utilisant un milieu d’immersion approprié. Les objectifs de microscope Nikon Super-Resolution Series comprennent l’huile CFI SR HP Apochromat TIRF 100XC (immersion dans l’huile, NA = 1,49), CFI SR HP Plan Apochromat Lambda S 100XC Sil (immersion silicone, NA = 1,35) et le plan CFI SR Apochromat IR 60XC WI (immersion dans l’eau, NA = 1,27). Ces objectifs fournissent certaines des NA les plus élevées dans leurs classes respectives.

Certains objectifs de la série Super-Resolution sont disponibles avec un collier de correction automatique, permettant un réglage très fin de la correction de l’aberration sphérique sans réglage manuel, garantissant la résolution et les performances d’imagerie 3D les plus élevées possibles.

Images confocales à balayage laser des cils cochléaires. Vues XY et XZ avec (droite) et sans (gauche) paramètres de résolution améliorés appliqués.

Résolution améliorée - Repousser les limites des technologies traditionnelles

Parfois, la résolution nécessaire pour répondre à votre question n’est pas trop éloignée du conventionnel et peut donc ne pas nécessiter certains des compromis exigés par les méthodes de super-résolution. Dans un tel cas, nous vous recommandons de considérer le potentiel de ce que nous appelons l’imagerie confocale à « résolution améliorée ».

Qu’est-ce que l’imagerie confocale à résolution améliorée ? Le point-clé à comprendre est que le microscope confocal traditionnel est déjà capable d’un certain degré d’amélioration de la résolution au-delà de ce qui est possible avec un microscope à champ large typique, une limite théorique d’environ 140 nm (XY) étant bien décrite. Cependant, atteindre cette limite nécessite l’utilisation d’une ouverture du sténopé infiniment petite. Heureusement, dans la pratique, une taille du sténopé d’environ 0,5 unités d’air peut être combinée avec une déconvolution itérative 3D post-acquisition pour approcher cette limite, avec une résolution d’environ 160 nm (XY) étant une cible réaliste pour une gamme de conditions d’imagerie.

Les microscopes confocaux à balayage laser Nikon AX / AX R sont capables d’une imagerie à résolution améliorée. Les avantages incluent la possibilité de régler avec précision la détection pour la plupart des fluorophores à spectre visible et la prise en charge de l’acquisition simultanée jusqu’à quatre canaux spectraux. Le sténopé est variable en continu et a une forme hexagonale (plutôt que carrée), permettant un réglage plus précis. Avec le modèle confocal à balayage résonnant AX R, il est possible d’imager à une fréquence vidéo (30 FPS) et plus rapidement tout en bénéficiant d’une résolution améliorée.

Glossaire

Canaux spectraux pris en charge: Cela fait référence au nombre de canaux spectraux (couleur) possibles qui sont pris en charge (en supposant une ligne laser pour chaque type de fluorophore).
Limite de profondeur d'imagerie relative: Cela indique la plage de profondeur Z (axiale) approximative dans laquelle le système indiqué peut fournir des images avec une qualité de sectionnement optique et un rapport signal/bruit suffisants. Cette valeur peut être assez variable et dépend fortement des propriétés optiques de l'échantillon et du récipient, ainsi que du marquage.
Limite de résolution optique relative: La limite de résolution pratique du système donné. La valeur de la résolution latérale (XY) est généralement différente de celle de la résolution axiale (Z). Si aucune valeur de résolution Z n’est donnée, aucune amélioration n’est apportée dans cette dimension.
Supports de microscope compatibles: Il s'agit des modèles de supports de microscope Nikon compatibles avec chaque système.
Taux d’acquisition d’images pris en charge: Les taux sont affichés en images par seconde (FPS).
Zone d’acquisition d’images maximale: Le plus grand champ de vision (mesuré dans l’espace échantillon) pris en charge par la technique utilisant le facteur de grossissement de l’objectif spécifié.