应用手册
使用AI-Driven全自动智能成像系统ECLIPSE Ji 进行的细胞毒性分析
2023年9月
ECLIPSE Ji搭载了Smart Experimen，与显微图像处理软件NIS-Elements SE结合使用，从图像获取到分析及图表创建可自动执行。训练有素的Artificial Intelligence (AI)和预定义成像流程将自动优化图像获取和分析条件的设置，因此通过简单的操作即可获得可视化数据和EC50信息。细胞毒性分析是各种细胞生物学研究中使用的通用分析方法，包括化合物和分子靶向药的药理作用、细胞培养产品的开发以及生命现象的阐明等。本应用指南中，介绍使用Smart Experiment的Cytotoxicity模块，使星形孢菌素剂量依赖性细胞死亡诱导可视化，计算出EC50以量化药物效果的示例。
关键词：细胞毒性、Live / Dead、细胞存活率、自动设置、EC50、剂量反应曲线
实验概要
(1) 将HeLa细胞接种到96孔板中，培养24小时。(2) 更换为含Hoechst 33342的培养基，培养30分钟。(3) 用含有EthD-1的培养基将受试物星形孢菌素调整为10种梯度浓度，添加到各孔中，处理细胞48小时。(4) 不更换培养基，将孔板放置到ECLIPSE Ji中，选择Cytotoxicity图标，自动进行图像获取和分析。
表1. 检测区域、荧光标记和图像获取条件
图1. 荧光图像和Mask
左：荧光图像【Hoechst 33342（蓝色：所有细胞的细胞核）、Ethidium homodimer-1（橙色：死细胞的细胞核）】
右：Mask
图像
结果
图2.用星形孢菌素处理48小时的HeLa细胞图像和剂量反应曲线
(A) 表示星形孢菌素剂量依赖性细胞死亡的剂量反应曲线（X轴：药物浓度（对数）、Y轴：死细胞的比例），EC50 = 112.716 ng/ml、Z’-factor = 0.90。(B, C, D) 合并的荧光图像上叠加Mask轮廓的图像（蓝色Mask：所有细胞的细胞核、橙色Mask：死细胞的细胞核），比例尺：100μm
图3. 分析结果
(A) 显示死细胞数比例的热图。
(B) 通过按孔分别显示细胞数的条形图（蓝色：所有细胞数、橙色：死细胞数、绿色：活细胞数）、孔板图视图显示，可直观地确认各孔中的药物反应。
通过Smart Experiment实现实验自动化，减少工序数
总结
- 证实了星形孢菌素剂量依赖性死细胞的比例增加。
- 可测量活细胞和死细胞的比例，自动创建剂量反应曲线，计算出EC50。
- Smart Experiment从图像的获取到分析及图表创建可全自动执行。
- 操作简单，将孔板放置到ECLIPSE Ji中，选择Cytotoxicity assay图标，输入样品信息即可。在本次实验条件下，从开始拍摄到图表显示用时约20分钟。
- 即使是厚底塑料多孔板，CellFinder.ai也可自动对焦，因此无需进行复杂的自动对焦设置。
- 繁琐的设置工作交给AI，研究人员可以专注于更具有创造性的研究活动。
样品制备protocol
将HeLa细胞按照6×10e3 cells/well的密度接种到96孔板中，在37℃、5% CO2的培养箱内培养24小时。更换为含有Hoechst 33342（2μg/ml）的培养基，在37℃、5% CO2的培养箱内染色30分钟。用含有4μM EthD-1的FluoroBright DMEM将星形孢菌素稀释为0 nM、0.152 nM、0.457 nM、1.41 nM、4.11 nM、12.3 nM、37 nM、111 nM、333 nM、1000 nM的浓度，分别添加到6个孔中。在37℃、5% CO2的培养箱内用星形孢菌素处理细胞48小时。为了防止死细胞脱落，不更换培养基，将孔板安装到ECLIPSE Ji中，进行图像获取和分析。
Tips
Cytotoxicity assay是一种测量活细胞和死细胞比例的分析方法。一般而言，DAPI无法对活细胞核进行染色。因此不要用DAPI，请使用Hoechst 33342对所有细胞的细胞核进行染色。此外，药物处理后如果实施清洗，死细胞会从孔板底面脱落，量化分析的精度将降低。
因此，药物处理后，请直接获取图像，勿清洗或固定细胞。
材料和试剂
适用容器＊
・ 24、48、96孔板
＊适用玻璃底及聚苯乙烯底的孔板。优先考虑细胞在底面的附着而非图像质量时，请使用聚苯乙烯底的孔板。
参考文献
Chae, HJ, et al., Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacol Res 42 (4):373-81 (2000).
产品信息
Smart Imaging System ECLIPSE Ji
ECLIPSE Ji是AI-Driven全自动成像系统。与NIS-Elements SE结合使用，可使图像获取、分析及图表创建无缝自动执行。
搭载CellFinder.ai，在需要人工进行精准判断的自动对焦设置中，由AI找到最佳焦平面。实装了学习多种图像获取以及分析流程方法的AI，由此大幅度削减设置和优化的工序数，任何人都能轻松获得结果。
显微图像处理软件NIS-Elements SE
SmartExperiment Basic Set
Cytotoxicity
- 从图像的获取到分析及图表显示可全自动执行。
- 可分析活细胞和死细胞的比例。
- 可一键创建报告，并以PDF形式输出图像、分析结果、剂量反应曲线、 EC50 /IC50计算结果。
- 使细胞成像和分析更轻松、更快捷。