应用手册
使用AI-Driven全自动智能成像系统ECLIPSE Ji进行的核易位分析
2023年9月
ECLIPSE Ji搭载了Smart Experiment，与显微图像处理软件NIS-Elements SE结合使用，从图像获取到分析及图表创建可自动执行。训练有素的Artificial Intelligence (AI)和预定义成像流程自动优化图像获取和分析条件的设置，因此通过简单的操作即可获得可视化数据和EC50信息。转录因子NF-κB作为癌症和炎症性疾病的药物标的广为人知。激活的NF-κB从细胞质转移到细胞核，并诱导与疾病相关的基因表达。本应用指南中，介绍使用Smart Experiment的Nuclear Translocation模块，量化TNF-α刺激后的NF-κB从细胞质向细胞核的易位。
关键词：核易位、信号传导、抗癌药、抗炎药、自动设置、EC50、剂量反应曲线
实验概要
(1) 将HeLa细胞接种到96孔板中，培养24小时。(2) 将受试物TNF-α调整成10种梯度浓度，添加到各孔中，培养30分钟。(3) 用4% PFA固定细胞。用0.1% Triton X-100进行膜透化。(4) 用Rabbit anti NF-κB p65 antibody（第一抗体）和Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 488)（第二抗体）进行荧光免疫染色。用DAPI对细胞核进行染色。(5) 将孔板放置到ECLIPSE Ji中，选择Nuclear Translocation图标，执行图像获取和分析，测量了NF-κB从细胞质向细胞核的易位。
| Detection region | Fluorescence label | Ex/Em (nm) |
|---|---|---|
| Nucleus region | DAPI | 345/455 |
| Target protein | Rabbit anti NF-KB p65 antibody (primary), Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor@ 488) (secondary) | 495/519 |
| Magnification | Field of view | |
| 20X | 0.88 × 0.88 mm | |
表1. 检测区域、荧光标记和图像获取条件
图2. Mask区域的定义与核易位的量化方法
上排：从DAPI检测到的细胞核区域内侧创建Nuclei Circle Mask（黄色)。在细胞核的外侧创建环形Mask （绿色），将其定义为细胞质区域。测量细胞核内侧（Nuclei Circle）与胞质环之间的荧光强度比，量化NF-κB的核易位。
中排：Control图像（NF-κB定位于细胞质）。
下排：对TNF-α200ng/mL处理30分钟的图像（NF-κB定位于细胞核）。HeLa细胞中的NF-κB(绿色)的免疫荧光染色图像。
图3. 对照组和TNF-α处理30分钟的HeLa细胞的图像及剂量反应曲线
(A, B) HeLa细胞中NF-κB（绿色）的免疫荧光染色图像，比例尺：100μm。(A) 对照组图像。(B) TNF-α 200 ng/mL处理30分钟的图像。(C) 显示TNF-α剂量依赖性NF-κB的核易位增加结果的剂量反应曲线。X轴：药物浓度（对数）、Y轴：细胞核与细胞质的荧光强度比（平均）、NucCyto Ratio: Nuclei Circle Fluorescence intensity/Cytoplasm Ring Fluorescence intensity 、EC50 = 0.950ng/ml、Z’-factor = 0.724。左图像：NF-κB定位于细胞质。右图像：NF-κB定位于细胞核。
总结
- 通过核易位模块，可量化TNF-α剂量依赖性NF-κB的核易位。EC50 为0.950ng/mL。
- 通过细胞核与细胞质区域的荧光强度比，可量化蛋白质的核易位，并计算出细胞因子和药物的EC50。
- Smart Experiment从图像的获取到分析及图表显示可全自动执行。
- CellFinder.ai可自动对焦，因此无需进行复杂的自动对焦设置。
- 图像的获取和分析的条件已预先定义，无需成像领域的专业知识。任何人都能轻松获得分析结果。
- 操作简单，将孔板放置到ECLIPSE Ji中，选择Nuclear Translocation图标，输入样品信息即可。在本次实验条件下，从开始拍摄到图表显示用时约20分钟。
- 繁琐的设置工作交给AI，研究人员可以专注于更具有创造性的研究活动。
样品制备protocol
- 将HeLa细胞按照1x10e4 cells/well的密度接种到96孔板中，在37℃、5% CO2的培养箱内培养24小时。
- 用培养基将TNF-α稀释为0、0.03、0.09、0.27、0.82、2.47、7.40、22.2、66.7、200ng/ml的浓度，将含0.1% BSA的各浓度培养基分别添加到6个孔中。在37℃、5% CO2的培养箱内用TNF-α处理细胞30分钟。
- 用PBS清洗细胞1次。
- 将4% PFA添加到孔中，在室温下静置10分钟，固定细胞。
- 用PBS清洗细胞3次。
- 将0.1% Triton X-100、0.1% BSA in PBS添加到孔中，在室温下静置5分钟，进行膜透化。
- 用PBS清洗细胞3次。
- 将用含0.1% BSA的PBS稀释后的第一抗体（1: 200）添加到孔中，在室温下静置1小时。
- 用PBS清洗细胞3次。
- 将用含0.1% BSA的PBS稀释后的第二抗体（1:500）添加到孔中，在室温下静置1小时。
- 用PBS清洗细胞3次。
- 将DAPI（2μg/ml）添加到孔中，在室温下静置5分钟。
- 用PBS清洗细胞3次。
材料和试剂
细胞培养
| 细胞 | HeLa (RIKEN RCB0007) |
|---|---|
| 增殖培养基 | MEM + 10%FBS + 1%Pc/Sm |
| 培养容器 | EZVIEW ® Culture Plate B (Glass Bottom Plate) Microplate 96 well (AGC techno glass (IWAKI), 5866-096) |
受试物
| 物质 | TNF-α |
|---|---|
| 试验浓度 | Negative control: 0 ng/ml |
| 孔板图示例 |  |
试剂
| 产品名称 | 产品目录编号 | 厂商名称 |
|---|---|---|
| Recombinant Human TNF-α | 300-01-A | PeproTech |
| Rabbit anti NF-κB p65 antibody (primary antibody) | ab16502 | Abcam |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor ® 488) (secondary antibody) |
ab150077 | Abcam |
| DAPI Solution | 62248 | Thermo Fisher Scientific |
| MEM (Minimum Essential Medium) | 11095080 | Thermo Fisher Scientific |
| Fetal bovine serum (FBS) | 10437028 | Thermo Fisher Scientific |
| Penicillin-Streptomycin (Pc/Sm) (10,000 U/ml) |
15140122 | Thermo Fisher Scientific |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% PFA) *Dilute by 4% with PBS before use |
11850-14 | Nacalai Tesque |
适用容器＊
- 24-well plate
- 96-well plate
＊仅适用玻璃底的孔板。
参考文献
Trask, OJ, Nuclear Factor Kappa B (NF-κB) Translocation Assay Development and Validation for High Content Screening. Assay Guidance Manual (2012)
产品信息
ECLIPSE Ji是AI-Driven全自动成像系统。与NIS-Elements SE结合使用，可使图像获取、分析及图表创建无缝自动执行。
搭载CellFinder.ai，在需要人工进行精准判断的自动对焦设置中，由AI找到最佳焦平面。实装了学习多种图像获取以及分析流程方法的AI，由此大幅度削减设置和优化的工序数，任何人都能轻松获得结果。
显微图像处理软件NIS-Elements SE
Nuclear Translocation (Option)
- 从图像的获取到分析及图表显示可全自动执行。
- 可全自动轻松分析蛋白质从细胞质向细胞核的易位。
- 可一键创建报告，并以PDF形式输出图像、分析结果、剂量反应曲线、 EC50 /IC50的计算结果。
- 使细胞成像和分析更轻松、更快捷。
通过Smart Experiment实现实验自动化，减少工序数
